淫羊藿女贞子配伍对维甲酸致大鼠骨质疏松模型的影响研究
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[摘要] 目的：探讨淫羊藿女贞子配伍对维甲酸致大鼠骨质疏松模型的影响。方法：3月龄雄性Wistar大鼠60只，随机分为正常对照组、模型对照组、淫羊藿组、女贞子组、淫羊藿女贞子配伍组、雷洛昔芬组。维甲酸灌胃2周建立大鼠骨质疏松模型，造模同时各给药组分别灌服相应药物治疗3周。测定血清钙（Ca）、磷（P）、碱性磷酸酶（AKP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（StrACP）含量，并观察股骨病理形态学变化。结果：模型组较对照组血清Ca，P含量显著降低，AKP，StrACP活性均显著升高，股骨头区骨小梁数目减少，窄小稀疏，断裂，呈典型的骨质疏松样改变；与模型组比较，各给药组均可显著提高血清Ca，P含量，下调血清AKP，StrACP水平，且骨小梁数目增加，变宽，密集交织呈网状，以配伍组作用最为显著。结论：淫羊藿女贞子可有效纠正骨代谢异常，改善骨组织病理状态，从而发挥抗骨质疏松作用，其中以二药配伍应用效果更佳。
[关键词]骨质疏松；维甲酸；淫羊藿/女贞子；实验研究骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以骨量减少和骨组织纤维结构退化，继而引起骨骼脆性和骨折危险性增加为特征的系统性骨骼疾病，目前已跃居为世界常见病发病率的第7位，其严重性已受到严密关注[1]，而中医药着重调动内因，整体调节，在防治本病方面具有较大的优势。OP属于中医“骨痿”、“骨痹”范畴，中医学认为OP的发生首先当责之于肾虚精亏，多采用补肾填精壮骨之法[2]。药对淫羊藿女贞子是名老中医徐辉光教授积30余年临床之经验而精选创制，临床4∶3配伍作为支气管患者缓解期用药，课题组前期研究结果证实[3]，平补肾中阴阳立法之淫羊藿女贞子配伍对大鼠哮喘模型激素干预治疗导致的骨代谢异常有良好的保护作用，提示二者配伍可能具有拮抗OP的作用。大量研究已证实单味淫羊藿及淫羊藿和/或女贞子相关复方在防治OP方面的显著效果[4-5]，但尚未见二药配伍防治OP的报道。本实验通过比较研究淫羊藿、女贞子单用及配伍对维甲酸致大鼠骨质疏松模型的影响，探讨二药配伍对骨代谢异常及骨组织病理状态的改善作用，为防治OP的进一步研究提供实验依据。
1材料
1.1动物 清洁级健康雄性Wistar大鼠60只，3月龄，体重（250±20） g，由北京维通利华实验动物技术股份有限公司提供，合格证号SCXK（京）2012-0001。
1.2试剂与药品 维甲酸（北京贝丽莱斯生物化学有限公司，批号120701）；羧甲基纤维素钠300～800 mPa・S（CP）（国药集团化学试剂有限公司，批号F20111021）；中药材制淫羊藿（批号23820701）、酒女贞子（批号1205042）均购于北京同仁堂药店；盐酸雷洛昔芬片（易维特）：规格为每片重0.258 5 g，相当于以C28H27NO4S・HCl计60 mg（礼来苏州制药有限公司，批号L02576）；氨基甲酸乙酯（乌拉坦）（天津市光复精细化工研究所，批号20110331）；AKP，StrACP，Ca，P测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20120920，20120925，20120912，20120921）。
1.3仪器 UV-1700紫外分光光度计（日本岛津公司）；Biofuge 15R低温生物离心机（Heraeus SEPATECH公司）；CP224C电子分析天平[0.000 1 g，奥豪斯仪器（上海）有限公司制造]；NIS-Elements BR 3.2图像分析软件；尼康（Nikon）ECLIPSE 80i 生物显微镜（北京锐驰恒业仪器科技有限公司）；莱卡2016型切片机（上海莱卡仪器有限公司）。
2方法
2.1分组 按随机数字表法分为6组，即正常对照组、模型对照组、淫羊藿组、女贞子组、淫羊藿女贞子配伍组（简称配伍组）、雷洛昔芬组（阳性对照组），每组10只。自由饮水、摄食。
2.2造模及给药 除对照组外，其余各组大鼠用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配成的维甲酸混悬液按70 mg・kg-1灌胃，对照组大鼠以0.5%CMC-Na灌胃，连续造模2周。在造模的同时，各组动物灌胃给予相应的药物或生理盐水，共计3周。①淫羊藿组：淫羊藿煎剂9.5 g・kg-1体重灌胃，每日1次；②女贞子组：女贞子煎剂9.5 g・kg-1体重灌胃，每日1次；③淫羊藿女贞子组：淫羊藿女贞子（4∶3）煎剂9.5 g・kg-1体重灌胃，每日1次；④雷洛昔芬组：雷洛昔芬片6.25 mg・kg-1体重灌胃，每日1次；⑤对照组、模型组：灌服与用药组等体积的生理盐水。
2.3取材及检测 大鼠禁食16 h后麻醉，腹主动脉取血，离心取血清，用于血清AKP，StrACP，Ca，P的检测，按照试剂盒说明书，均采用比色法检测。完整分离大鼠的左侧股骨，剔除所有附着的肌肉和结缔组织，以10%甲醛溶液固定，HE染色后行病理学检查。
2.4统计学方法 数据采用±s表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析，根据方差齐性检验结果选择LSD（方差齐）或Tamhane′s T2（方差不齐），采用SPSS 18.0软件包完成。
3结果
3.1各组大鼠体重的比较 实验开始时各组体重均无差异；实验结束时，模型组大鼠体重较对照组显著下降（P
3.2各组大鼠血Ca，P含量的比较 与对照组比较，模型组血Ca，P含量显著降低（均P
3.3各组大鼠血清AKP，StrACP含量的比较 模型组血清AKP活性较对照组显著升高（P
3.4大鼠骨组织病理形态学比较 对照组骨小梁大小粗细均匀，整齐排列并连接成网。模型组骨小梁数目明显减少，变窄变细且稀疏，小梁间隙增大；骨小梁断裂，可见游离末端，结构扭曲不完整，排列松散，大部分不能连接成网状，呈典型的骨质疏松样改变。各给药组与模型组比较，骨组织病理形态均有不同程度的改善，骨小梁数量增加，变宽，小梁间隙变小，排列尚整齐并相互连接，其中以配伍组改善作用最为显著。配伍组较单用淫羊藿、女贞子组及阳性药组骨小梁粗大饱满，间隙小，排列整齐，密集交织呈网状，见图1。
4讨论
随着社会老龄化，OP的发病率逐年增加，已成为影响我国社会的一个重要公共健康问题，筛选及开发抗OP药物具有重要意义。目前西药针对本病的治疗多采用钙制剂和维生素D、双磷酸盐类、降钙素、选择性雌激素受体调节剂等药物[2]，虽取得了一定疗效，但多需联合使用，加之治疗费用高，不良反应多及潜在的致癌性等弊端，使其临床应用受到限制，治疗现状并不理想。与西药相比，中医药在OP的防治过程中着重调动内因，辨证论治，整体调节。OP属于中医“骨痿”“骨痹”范畴，从中医角度而言，肾藏精主骨生髓，肾精充实则骨髓生化有源，骨得其养则坚固有力；若肾精亏虚则骨髓化生乏源，骨失其养则会出现骨骼脆弱，腰膝酸软等。故肾虚精亏是本病的病机关键，从肾论治是中医治疗本病的基本原则。中药淫羊藿温肾壮阳、坚筋骨，女贞子滋补肝肾，二药配伍应用平补肾中阴阳，更切合OP的中医发病机制。此外，OP属于慢性复杂性病证，须长期服药，补阳药淫羊藿性质温燥不宜长期临床应用，若能配伍补益肾中的女贞子以阴中求阳，则可达到《景岳全书・新方八略》中言：“此阴阳相济之妙用也。”故本实验通过单味药与药对配伍的作用比较，评价平补肾中阴阳之药对淫羊藿女贞子对维甲酸致大鼠骨质疏松模型的防治作用。
维甲酸（retinoic acid，RA）是维生素A的衍生物，临床主要用于皮科银屑病、痤疮，白血病，肿瘤等的治疗，具有致骨质疏松的副作用。由于维甲酸致骨质疏松模型在骨组织病理形态变化上的典型性以及药物干预治疗后的可逆转性，该模型已被世界卫生部列为评价骨质疏松药物疗效的标准模型之一[6]。该模型采用维甲酸70 mg・kg-1连续灌服2周，即可出现大鼠体重减轻，弓腰塌背，跛足以及骨密度减少，骨小梁稀疏断裂，骨代谢紊乱，性激素水平及骨生物力学性能下降等骨质疏松表现[6-8]。本实验结果显示的多种病理变化与文献报道一致，表明OP模型制备成功。
骨代谢生化指标对于反映骨细胞活性及骨矿物质的转换情况，同时评价药物对骨转换的干预作用具有重要意义。抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，StrACP）主要由破骨细胞释放，可进入血循环，在骨吸收活跃的状态下StrACP含量升高，故血中StrACP水平可反映破骨细胞活性及骨吸收状态。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）是反映骨代谢的灵敏指标，破骨或成骨占优势均升高，骨更新率增加的代谢性骨病血清AKP显著升高[9]。维甲酸诱导骨质疏松的机制目前还未完全清楚，一般认为其不抑制成骨细胞活性，主要是通过激活破骨细胞的增殖分化，促进骨吸收作用，从而使骨代谢呈现骨吸收大于骨形成的高转换型改变，最终导致骨量丢失[10]。本实验结果显示，造模后大鼠血清AKP，StrACP含量均显著升高（P
Ca，P是骨矿物质中最基本的元素，在骨代谢中起着重要的作用，骨代谢其实就是机体内Ca，P代谢，即骨组织不断地将储存的Ca，P释放到血液中，同时又将血中Ca，P回存于骨骼中，以保证骨代谢的稳态[11]。本实验结果显示，模型组大鼠血清Ca，P含量显著降低（均P
骨组织形态学是评价骨转换与骨结构的有效手段。有研究表明[12]，在探讨药物对维甲酸致骨质疏松的作用机制时，血液生化指标仅从侧面反映药物对骨形成和骨吸收的影响，还应将骨质的变化放在首要位置，而骨组织形态结构是判断骨质不可或缺的关键性金指标。骨质疏松的主要病理学表现是骨组织显微结构的异常，尤其是松质骨区域骨小梁的病理改变。骨小梁合理的立体网状结构和排列可使骨承受压力和拉力的能力增强，在骨生物力学性能中起着重要的作用，骨小梁的微细变化即可使骨强度明显下降[13]。本实验结果显示，模型组骨小梁数目减少，窄小稀疏，而且骨小梁出现断裂，不能连接成网状，提示造模后骨小梁结构遭到破坏，骨形态呈现典型的骨质疏松样改变。而用药后骨小梁数量增加，变宽，并相互连接，尤其配伍组骨小梁粗大饱满，密集交织呈网状。提示淫羊藿女贞子可有效逆转骨组织病理样改变，使疏松的骨质得以恢复到正常水平，二药配伍改善效果更佳。
综上所述，淫羊藿女贞子可有效纠正维甲酸致骨质疏松模型骨代谢异常，明显改善骨组织病理状态，从而对骨质疏松症起到一定的防治作用，二药配伍较单味药应用效果更佳。
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Study on effect of combination of Epimedii Folium and Ligustri Lucidi
Fructus on osteoporosis rats induced by retinoic acid
KANG Xue1， LI Zhan1， ZHANG Wei-hua2， ZHOU Qi3， LIU Ren-hui1*， WANG Xiu-juan1*
（1. School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China；
2. Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai University of
Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200437， China；
3. Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100010， China）〖JZ）〗
[Abstract] Objective： To explore the effect of combination of Epimedii Folium and Ligustri Lucidi Fructus on osteoporosis rats induced by retinoic acid. Method： Sixty three-month-old male Wistar rats were randomly divided into the normal control group， the model group， the Epimedii Folium group， the Ligustri Lucidi Fructus group， the combination group of Epimedii Folium and Ligustri Lucidi Fructus and the raloxifene group. The osteoporosis model was established through oral administration with retinoic acid for two weeks. Meanwhile， all of treatment groups were administered with corresponding drugs for three weeks. The contents of serum calcium （Ca）， phosphorus （P）， alkaline phosphatase （AKP） and tartrate-resistant acid phosphatase （StrACP） were detected， and the pathomorphological changes of femurs were observed. Result： The model control group showed much lower contents of serum Ca and P than the normal control group， but with significantly higher AKP and StrACP activity than the normal control group. The femoral head area showed reduced， narrow and sparse trabecular bones， with typical osteoporosis-like changes. Compared with the model control group， all of treated groups showed significant increase in Ca and P contents in serum， and down-regulate AKP and StrACP levels， while trabecular bones became more and wider， and densely interweaved as a reticular formation. Among them， the combination group showed the most significant effect. Conclusion： Epimedii Folium and Ligustri Lucidi Fructus could effectively correct the abnormal bone metabolism and improve pathological conditions of bone tissues， so as to show the anti-osteoporosis effect. The combined application of the two drugs showed a better efficacy.
[Key words] osteoporosis； retionoic acid； Epimedii Folium/Ligustri Lucidi Fructus； experimental study
doi：10.4268/cjcmm20132327