一株产纤维素酶菌株的筛选及酶学性质
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摘要：以羧甲基纤维素钠为惟一碳源，从土壤中筛选出一株产纤维素酶的菌株ＸＷ－１３，其摇瓶培养液的ＣＭＣ酶活力为１５．０５ μｇ／ｍＬ，滤纸酶活力为１５．１３ μｇ／ｍＬ。酶学性质试验表明，该酶的最适反应ｐＨ ７．０，在ｐＨ ５．０～９．０时有较好的稳定性，酶活力保持６０％以上。该酶的最适反应温度为４０ ℃，在温度为２０ ℃时基本稳定，保温２ ｈ仍有８０％以上的活力。在化合物浓度为０．２ ｍｇ／ｍＬ的条件下，ＮＨ４＋、Ｎａ＋、Ｆｅ２＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋和Ｌｉ＋对酶活力有增进作用，Ｈｇ＋和Ｃｕ２＋对酶活力有抑制作用。
中图分类号：ＴＱ９２０．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）08－1566-03
纤维素是自然界中最丰富的可再生资源，是植物通过光合作用储能的主要形式［１］。关于土壤中纤维素酶的研究为充分利用纤维素提供了一条广阔的途径［２］。目前关于纤维素酶的研究报道集中于真菌与细菌方面，真菌主要以木霉为主［３－６］。纤维素酶是一类可以水解β－１，４葡萄糖苷键，使纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖的一个酶系的总称［７］。该酶系是由葡聚糖内切酶（Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ，ＥＧ， ＥＣ３．２．１．４）、葡聚糖外切酶（Ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ＣＢＨ，ＥＣ３．２．１．９１）、β－葡萄糖苷酶（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＢＧ， ＥＣ３．２．１．２１）３个组分组成的诱导复合酶系［８］。
目前，纤维素酶的应用日益广泛，而纤维素酶高产菌却相对较少，因此高产纤维素酶菌株的筛选是关键问题之一［９］。从土壤中筛选到一株产纤维素酶的菌株，并对该菌株进行了产酶条件和酶学性质的研究，以期为纤维素酶产生菌的开发利用打下基础。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１土壤样品与化学试剂土壤样品采自树木种植地；化学试剂购于国药集团，均为分析纯。
１．１．２培养基富集培养基：羧甲基纤维素钠４．０ ｇ，ＮＨ４Ｃｌ ５．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４ １．０ ｇ，去离子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２。分离培养基：羧甲基纤维素钠４．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ４．０ ｇ，ＫＣｌ ５．０ ｇ，ＮａＮＯ３ ３．０ ｇ， Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，琼脂１８．０ ｇ，去离子水１ ０００ ｍＬ，自然ｐＨ。种子培养基：羧甲基纤维素钠 ８．０ ｇ，酵母粉 ５．０ ｇ，蛋白胨３．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ５．０ ｇ，ＫＣｌ ５．０ ｇ，ＮａＮＯ３ ３．０ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，去离子水１ ０００ ｍＬ，自然ｐＨ。发酵培养基：羧甲基纤维素钠 １５．０ ｇ，大豆蛋白胨 ８．０ ｇ，酵母粉 ４．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．２５ ｇ，去离子水１ ０００ ｍＬ，自然ｐＨ。ＬＢ培养基：胰蛋白胨１０．０ ｇ，酵母膏 ５．０ ｇ，ＮａＣｌ ５．０ ｇ，去离子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０。ＬＡ培养基：ＬＢ培养基中加入１．８％的琼脂粉。
１．２方法
１．２．１纤维素酶产生菌的筛选与粗酶液的制备 取１００ μＬ土壤样品溶液置于富集培养基中，在３７ ℃培养２４ ｈ，将富集液用无菌水梯度稀释，涂布于琼脂分离培养基上，倒置于３７ ℃恒温培养箱中培养２４ ｈ，然后用刚果红染色法［８］染色５ ｍｉｎ，去离子水冲洗后放置５ ｍｉｎ，观察菌落周围有无透明圈，若有透明圈则初步证明该菌株具有产纤维素酶的能力，挑取透明圈较大的单菌落进行划线，进一步分离纯化。将初筛得到的菌株接入种子培养基培养１２ ｈ，以２％的接种量转接到发酵培养基中培养２４ ｈ，然后4 ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，收集发酵上清液为粗酶液。用ＤＮＳ法测定酶活力。
１．２．２纤维素酶活力的测定纤维素酶（ＣＭＣ酶，滤纸酶）活力测定均参照２００３年９月１３日的中华人民共和国轻工行业标准《纤维素酶制剂》进行［１０］。酶活力定义：在上述试验条件下，1 mＬ酶液水解底物产生相当1 μg葡萄糖的还原糖量为1个酶活力单位，以μg/mL表示。
１．２．３酶学性质的研究
１）最适反应ｐＨ。配制不同ｐＨ的浓度为０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的缓冲液，缓冲体系及其ｐＨ分别为：ＫＣｌ－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ ２．０）；甘氨酸－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ ３．０）；柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液（ｐＨ ４．０～５．０）；磷酸缓冲液（ｐＨ 6.8～8．０）； 甘氨酸-ＮａＯＨ缓冲液（ｐＨ 9.0～10．０）；Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＯＨ缓冲液（ｐＨ ９．０～１２．０）。在ｐＨ ２．０～１２．０条件下进行酶活力测定。以酶活力最大值为１００％，在其他条件下测得的酶活力相对于最大酶活力的比例即为该酶的相对酶活力［１３］。
２）ｐＨ稳定性。将酶液与不同ｐＨ的缓冲液混合，４０ ℃保温３ ｈ后测定剩余酶活力。
３）最适温度。不同温度条件（２５～６０ ℃）下，在ｐＨ为７．０的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液中反应３０ ｍｉｎ，测定相对酶活力。
４）温度稳定性。不同温度条件（２０～８０ ℃）下，在ｐＨ为７．０的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液中保温不同时间后立即冷却，随后进行纤维素酶活力测定。
５）NH4+及金属离子对纤维素酶活力的影响。将NH4+及金属离子与酶液于２０ ℃条件下保温２ ｈ后测定样品剩余的酶活力，以不添加任何离子的对照酶活力为１００％，在NH4+及金属离子存在条件下的酶活力相对于对照酶活力的比例即为添加NH4+及金属离子后的相对酶活力。
２结果与分析
２．１酶活力测定回归方程的建立
分别取10 ｍｇ／ｍＬ的葡萄糖标准液０．０、０．25、0.50、0.75、１．０0、１．25、1．5０、1．75 ｍＬ置于２５ ｍＬ具塞试管中，用去离子水补足至２．０ ｍＬ，加入２．０ ｍＬ ＤＮＳ试剂。置于沸水中煮沸５ ｍｉｎ显色，然后迅速冷却，用去离子水定容至２５ ｍＬ，以空白液为对照，置于５４０ ｎｍ处测定吸光度。结果（图１）表明，当葡萄糖浓度为０~０．７ mｇ／mＬ时，吸光度（ｙ）与葡萄糖浓度（ｘ）之间呈良好的线性关系，回归方程为■＝１．６20 ２ｘ－０．０１４ 0，相关系数ｒ＝０．９９９ 4。
２．２纤维素酶产生菌的筛选
通过ＣＭＣ－Ｎａ为底物的平板筛选法，从土壤中筛选出多株降解纤维素的菌株，其中ＸＷ－１３菌株在平板上经刚果红处理后透明圈直径与菌落直径比值为８．７５，将分离纯化的菌株摇瓶发酵２４ ｈ后培养液中ＣＭＣ酶活力为１５．０５ μｇ／ｍＬ，滤纸酶活力为１５．１３ μｇ／ｍＬ。
２．３纤维素酶酶学性质的研究
２．３．１ｐＨ对相对酶活力的影响在不同ｐＨ条件下测得的酶活力相对于最大酶活力的比例即为该酶的相对酶活力。结果（图２）表明，ＣＭＣ酶最适酶促反应ｐＨ ７．０；ｐＨ ４．０~６．０，相对酶活力随着ｐＨ的升高而迅速增加，在ｐＨ ４．０时相对酶活力仅有１５．４％左右；ｐＨ ７．０~９．０，相对酶活力随着ｐＨ的升高而迅速下降，在ｐＨ ９．０时相对酶活力只有２３．０％左右。滤纸酶最适反应ｐＨ ７．０；ｐＨ ３．０~６．０，相对酶活力随着ｐＨ的升高而迅速增加，在ｐＨ为３．０时相对酶活力仅有４．７％左右；ｐＨ ８．０~１０．０，相对酶活力随着ｐＨ的升高而迅速下降，在ｐＨ １０．０时相对酶活力为２．３％。
２．３．２ｐＨ对酶稳定性的影响将酶液与不同ｐＨ的缓冲液充分混合，４０ ℃保温３ ｈ后测定剩余酶活力。结果（图３）表明， ＣＭＣ酶相对酶活力在ｐＨ ５．０～９．０时具有较好的稳定性，相对酶活力为７０％以上，ｐＨ低于５．０或高于９．０时相对酶活力骤降，ｐＨ ３．０时相对酶活力降为１２．５％，ｐＨ １１．０时相对酶活力降为１４．２％。滤纸酶相对酶活力在ｐＨ ５．０～９．０时具有较好的稳定性，相对酶活力为６０％以上，ｐＨ低于５．０或高于９．０时相对酶活力骤降，ｐＨ ３．０时相对酶活力降为２２．７％，ｐＨ １１．０时相对酶活力降为１７．３％。
２．３．３温度对相对酶活力的影响在不同温度条件（２５～６０ ℃）下，ｐＨ为７．０时０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液中，反应３０ ｍｉｎ测定相对酶活力。结果（图４）表明，在４０ ℃时ＣＭＣ酶与滤纸酶具有最高酶活力。２５ ℃时ＣＭＣ相对酶活力为１９．２％，滤纸酶相对酶活力为１０．７％。温度从２５ ℃到４０ ℃，酶活力随温度升高而升高；温度从４０ ℃到６０ ℃，酶活力随温度升高而降低，温度为６０ ℃时，ＣＭＣ酶相对酶活力为１６．９％，滤纸酶相对酶活力为６．７％。
２．３．４温度对酶稳定性的影响以常温放置的酶液相对酶活力为１００％。将酶液于不同温度下保温不同时间后立即冰水浴冷却，测定酶活力。图５表明，在２０ ℃的条件下ＣＭＣ酶具有最好的稳定性，１８０ ｍｉｎ后还具有８０％左右的酶活力。当温度到达５０ ℃以上时，３０ ｍｉｎ内ＣＭＣ酶活力下降迅速，３０ ｍｉｎ后相对酶活力不到４０％。从图６可以看出，在２０和３０ ℃时滤纸酶具有较好的稳定性，１８０ ｍｉｎ后还具有７０％左右的酶活力。当温度到达５０ ℃以上时，６０ ｍｉｎ内滤纸酶活力下降迅速，６０ ｍｉｎ后相对酶活力不到３０％。
２．３．５ＮＨ４+及金属离子对酶稳定性的影响以发酵培养基不添加任何金属离子为对照，即酶活力１００％。随后添加浓度为０．２ ｍｇ／ｍＬ的不同化合物，与酶液在２０ ℃条件下保温２ ｈ后测定样品剩余酶活力，计算相对酶活力，结果如图７。从图7可以看出，加入ＦｅＳＯ４滤纸酶活力略有下降，CMC酶活力略有上升，而加入ＬｉＳＯ４、ＭｎＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＭｇＣｌ２和ＣａＣＯ３ ＣＭＣ酶和滤纸酶活力均有所上升；加入（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮａＣｌ和ＫＣｌ后酶活力有一定幅度上升，加入（ＮＨ４）２ＳＯ４后ＣＭＣ酶相对酶活力达到了１４５.0％，滤纸酶相对酶活力达到了1３４.0％；加入Ｈｇ＋与Ｃｕ２＋对两种酶活力均有一定抑制作用。
３小结
随着科学技术的发展，纤维素酶的作用日益凸显，其在饲料、粮食加工、蔬菜水果加工、副食品酿造以及纺织等各个方面都具有重要作用，其分解秸秆产生燃料乙醇也为新能源的开发研究打下了理论基础［１４］。因此近年来关于纤维素酶的研究层出不穷。从土壤中筛选了一株产一定活力纤维素酶的菌株ＸＷ－１３，其ＣＭＣ酶活力达到１５．０５ μｇ／ｍＬ，滤纸酶活力达到１５．１３ μｇ／ｍＬ，高于国内一些文献报道的酶活力［１３-１５］。ＸＷ－１３在ｐＨ ７．０，温度为４０ ℃的情况下具有最高酶活力。在２０ ℃具有最好的酶稳定性。加入Ｃｕ２＋与Ｈｇ２＋对酶活力有一定抑制作用，ＮＨ４+、Na+、K+对酶活力有一定促进作用。
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