基于Cyt b基因的乌花杂交龟系统进化关系研究
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摘要：利用PCR方法克隆乌花杂交龟线粒体DNA的细胞色素b基因（Cyt b基因），并结合GenBank中已公布的22种龟鳖类动物同源序列进行了序列变异比较和系统发生分析，采用NJ（Neighbor-joining）法和UPGMA法构建分子系统树。结果表明，乌花杂交龟与中华草龟（Chinemys reevesii）以很高的置信度聚成一支，再与中华花龟（Ocadia sinensis）聚成一组。
关键词：中华草龟（Chinemys reevesii）；中华花龟（Ocadia sinensis）；杂交龟；Cyt b基因；系统进化
中图分类号：Q959.6+3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）17-4167-04
Study on the Phylogenetic Relation of Hybrid Turtle（Chinemys reevesii×Ocadia sinensis） Based on Cyt b Gene
HE Gang1，2，HE Li1，FANG Chun-lin2，FEI Chun-ping3，CHENG Bi-jun4
（1.Yangtze River Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Wuhan 430223， China； 2.Scientific Observing and Experimental Station of Fishery Resources and Environment in Poyang Lake， Ministry of Agriculture/Fisheries Research Institute of Jiangxi Province， Nanchang 330039， China； 3.Jiangxi Jinguiwang Business Co.，Ltd.， Shangrao 334400， Jiangxi， China；4.Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）
Abstract： The complete sequences of Cytochrome b（Cyt b）gene in the hybrid turtle were amplified by using PCR technology. Meanwhile， the homologous sequences of other 22 turtle species were obtained from the GenBank. Based on these data， the sequence variation and the phylogenetic relationship of these groups were analyzed. The phylogenetic trees were constructed using Neighbor-joining（NJ）and UPGMA methods. The results showed that the hybrid turtle and Chinemys reevesii firstly gathered into one clade，and then formed a group with Ocadia sinensis.
Key words： Chinemys reevesii； Ocadia sinensis； hybrid turtle； Cyt b gene；phylogenetic evolution
收稿日期：2013-03-13
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（201003076）
作者简介：贺 刚（1982-），男，湖北天门人，助理研究员，硕士，主要从事种质资源与鱼类分子生态学研究，（电话）15070865732（电子信箱）
；通讯作者，何 力，研究员，（电子信箱）。
中华草龟（Chinemys reevesii）俗称乌龟、泥龟、草龟，隶属于龟鳖目（Testudinate）地龟科（Emydidae）乌龟属（Chinemys）；而中华花龟（Ocadia sinensis）又名花龟、珍珠龟、台湾草龟，隶属于龟鳖目（Testudinate）潮龟科（Bataguridae）花龟属（Ocadia）。除我国东北部和西部区域外，中华草龟在我国各地均有分布，而在国外主要分布于日本和朝鲜[1]；中华花龟主要分布于我国南部、台湾及越南北部。两种龟的人工繁殖及饲养已获得成功，中华草龟的养殖规模较大，而中华花龟养殖规模较小[2]。目前已发现20多种杂交龟，部分是人工培育而成，如乌花杂交龟、乌黄喉杂交龟等。近年来，尽管新杂交龟品种日益增加，但是其相关研究鲜有报道，仅见金石杂交龟[3]、乌花杂交龟[4，5]，在分类学上不同属间的杂交为属间远缘杂交。
线粒体DNA（mtDNA）作为核外遗传物质，具有结构简单、母系遗传、进化速度快、拷贝数多等特点，在动植物种群遗传结构分析、物种及品系鉴定方面得到了广泛的应用[6，7]。细胞色素b（Cyt b）是线粒体编码的为数不多的功能蛋白之一，在进化上较为保守，通常被用于分子进化和系统发生的研究。本研究利用线粒体Cyt b基因分析乌花杂交龟的序列全长，并结合龟鳖目其他物种同源序列进行序列分析和系统进化树的构建，探讨乌花杂交龟在淡水龟科的地位及系统分化关系，为龟类动物种质保护和杂交选育提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
乌花杂交龟（中华花龟×中华草龟）由江西省乌龟良种场提供。
1.2 基因组DNA的提取
解剖乌花杂交龟，取少许肌肉组织，用无水乙醇浸泡，置于-20 ℃保存。提取基因组DNA，采用SDS/蛋白酶K消化，氯化钠-氯仿抽提和乙醇沉淀，以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测浓度后，置于-20 ℃保存备用。
1.3 引物设计及PCR扩增
参照中华草龟线粒体Cyt b基因序列，设计1对特异性扩增引物：Cytb F：5′-CATACACG CMTTCT
TYAAAGC-3′；Cytb R：5′-CTAATAGTGATCCGAAG
TTTCAT-3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增反应体系为：10×PCR缓冲液5 μL，2.5 mmol/L MgCl2 5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 pmol/L上、下游引物各2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）2 U，模板DNA（约100 ng）1 μL，加无菌水补至50 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物回收纯化后，以两端引物作测序引物，送至北京天一辉远生物科技有限公司进行双向测序。
1.4 序列分析
利用Clustal X软件对测序结果与GenBank中同源序列进行DNA序列分析并人工校正。应用Mega4.1软件分析统计不同序列的保守位点、可变位点、简约信息位点、4个碱基含量及遗传距离等数据。在Kimura-2-Parameter方法模型的基础上，用UPGMA法和Neighbor-joining（NJ）法构建系统发生树，Boot-strap重复检测分子系统树的置信度。
2 结果与分析
2.1 序列组成及变异
通过测定乌花杂交龟线粒体Cyt b基因全长序列，BLAST比对另外22种淡水龟科物种及中华鳖同源区序列后，对位排列共有1 150个位点， 其中682个保守位点， 468个变异位点，含318个简约信息位点，位点变异率为40.7%。
序列中T、C、A、G含量分别为27.4%、31.2%、29.2%、12.2%（表1），结果显示G碱基相对缺乏， 其中A+T含量（56.6%）高于C+G含量（43.4%）。从氨基酸密码子来看，第1位点A碱基的频率最高为28.3%，第2位点T碱基的频率较高为39.0%，第3位点C碱基的含量高达40.2%，而G碱基的含量最低。
2.2 碱基替换和遗传距离分析
不同物种序列间的碱基替换情况和基于Kimura-2-Paramete模型校正后的遗传距离见表2。物种间序列位点变异表现为转换多于颠换，R（转换/颠换）平均值为3.60。脊椎动物中转换率往往高于颠换率，cyt b基因密码子主要发生在第3位点，其替换频率显著高于前2位。
采用Mega4.1软件计算各龟鳖群体间的K2P距离。在23个物种中，遗传距离在0.01～0.28之间。其中，最小的在金头闭壳龟与三线闭壳龟、齿缘龟与条颈龟之间，遗传距离均为0.01；而外群的中华鳖与内群龟科物种的遗传距离均较大，在0.26～0.28之间。乌花杂交龟在21种内群龟的遗传距离为0.02～0.16。杂交龟与中华草龟遗传距离最小（0.02），与中华花龟次之（0.03），与条颈龟和果龟最大（0.16）。在内群中，属间龟类群体的遗传距离在0.04～0.17之间。其中，乌花杂交龟与乌龟属遗传距离最小（0.04），而闭壳龟属与果龟属的遗传距离最小（0.17）。
2.3 系统发育分析
用不同的聚类方法和遗传距离得到NJ树（图1）和UPGMA树（图2），都采用Kiumra双因子参数构建模型。其中NJ树显示，闭壳龟属和锯缘龟属先聚为一类，而乌花杂交龟、乌龟属、花龟属和拟水龟属聚为一类，两者再聚为一大类；然后与眼斑龟属聚为一大支。齿缘龟属和果龟属则聚为一大支。UPGMA树结果与NJ树结果相似。
3 小结与讨论
3.1 乌花杂交龟和亲本的形态差异与分子标记
乌花杂交龟与其亲本差异较为显著，主要表现在背甲纹路、腹甲黑斑、头颈部及四肢尾覆面的皮肤颜色。在形态学上，杂种部为浅橄榄色，头部眼后有数条黄绿色条纹；背甲为浅栗色和黄褐色；腹甲棕黄色，每一盾片具一大块墨渍状斑块；四肢、尾部及皮肤均有数条成点状间断的黄绿色条纹[8]。
Morita等[9]研究报道细胞色素b基因种间的分歧度为1%～10%。一般情况下，分歧度能较好反映出物种的进化速度差异。细胞色素b基因是线粒体基因组上13个蛋白编码基因之一，进化速率快，变异程度高，因而被认为是探讨近缘种间和种内遗传分化程度的良好指标。张永正等[10]利用线粒体DNA细胞色素b基因序列对中华鳖5个不同地理种群遗传结构进行分析。结果表明，日本群体的两种单倍型序列上的稳定差异，可以成为种群鉴别的分子标记。本研究对乌花杂交龟及其他22种龟鳖类动物的线粒体Cyt b基因全长序列测定表明，共有1 150个位点， 其中变异率为40.70%，这些DNA序列差异可以作为区分乌花杂交龟与其他龟类的分子标记。
3.2 乌花杂交龟在内群中的系统发生关系
从2个系统发生树中，可以看出乌花杂交龟与亲本的关系。乌花杂交龟与母本中华草龟的关系最近，是并系的，而后与父本中华花龟合并成一个单系。贺刚等[8]采用聚类分析从形态学特征研究表明，乌花杂交龟形态上接近母本乌龟（中华草龟），本研究从分子生物学角度验证了这一观点，这与线粒体DNA母系遗传的观点较为一致。
从内群不同属的系统关系来看，乌龟属、花龟属和拟水龟属合并为一大类，且有较高的支持率，而乌花杂交龟明显属于这大类中。这与Cyt b基因序列与采用12S rRNA和16S rRNA、SINE基因序列的核DNA的研究结果是一致的[11]，3属的亲缘关系很近，是并系的。张艳云等[12]认为可以将乌龟属、花龟属和拟水龟属合并为同一属，本研究从分子系统树的结果支持这一观点。但在形态特征如体色、体形和生长性状等方面来说，乌龟属、花龟属和拟水龟属差异显著，造成的原因可能是不同环境选择压力下导致物种在形态上差异[13]。本研究分析了乌花杂交龟的系统分化特征，但Cyt b基因序列较短，提供的遗传背景资料有限，还需采用多种分子标记综合分析，以及更多形态学、生理学等多学科方面的证实，才能得到更准确的结论。
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