反复快速皮肤扩张对皮瓣EGF表达的影响

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摘要：目的 研究反复快速扩张方式的扩张机理。方法 62只雄性新西兰大白兔随机分为ABCDE五组。各组于不同时期取扩张皮肤标本进行HE染色及EGF免疫组织化学染色对比观察。SPSS11.5统计软件进行统计学处理。结果 组织学观察：AC两组在不同维持期组织学表现接近。B组在维持期1-3周均有大量胶原纤维断裂，且表皮层厚度增加不明显。DE两组无区别。EGF结果 在维持一周ABC表达无差异，维持两周AB无差异但两组均与C组有显著差异，维持4周三组表达无差异。结论 反复快速皮肤扩张可能通过促进组织细胞合成与分泌EGF来提高扩张皮肤的修复质量；反复快速皮肤扩张方式可以有效缩短皮肤扩张修复治疗疗程。

关键词：皮肤扩张术；软组织扩张器；免疫组织化学

中图分类号：R322.99 文献标识码：A 文章编号：1004-4949（2013）03-00-02

皮肤软组织扩张术[1]目前作为常规治疗方法在临床广泛应用，但其扩张机理仍不十分明确。本研究拟采用一种新型的扩张方式探讨其扩张机理及临床应用的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

62只6月龄雄性新西兰大白兔，体重2-3Kg，由河北医科大学动物实验中心提供（冀医动管字610063）。分笼饲养统一饲料自由饮食。随机分为5组，A组20只为反复快速扩张组，以取材时间点随机分为5组每组4只；B组20只为快速扩张组同上分为5组每组4只；C组16只为常规扩张组同上分为4组每组4只；D组5只为对照组同上分为5组每组1只；E组1只为正常对照组。

1.2 动物模型制备

2.5/L戊巴比妥钠（25mg/Kg）耳缘静脉注射全身麻醉。自两耳根后缘连线间横行切开，钝性分离至两侧眶骨上缘1cm，前部距鼻翼2cm处。植入肾形扩张器（植入前注射无菌生理盐水检查有无渗漏）埋入颈部皮下，严密缝合。自注射壶注入无菌生理盐水5ml。术后即刻肌注庆大霉素8万单位并每日肌注8万单位至术后3天。扩张器植入3天后开始扩张。

A组：每日扩张1次，每次注入无菌生理盐水20ml维持30min，抽出全部，维持3小时，重复3次，最后一次抽出15ml，每日重复。10日完成扩张；B组：每日扩张1次，每次注入无菌生理盐水5ml，10日完成；C组：每3日扩张1次，每次注入无菌生理盐水5ml，30日完成；D组：单纯埋入扩张器，不扩张皮肤；E组：不进行任何干涉。

1.3 标本采集与处理

A、B组分别于扩张完成后维持期1、2、3、4及6周随机抽取4只取标本；C组于维持期1、2、3、4周随机抽取4只取标本；D组于扩张1、2、3、4、6周随机抽取1只取标本。于采集时间点A、B、C组全麻下自扩张皮瓣中央处切取1cm×1cm大小的扩张全层皮肤组织；D组自扩张器位置中央处切取4块0.5cm×0.5cm大小的全层皮肤组织块；E组于动物头顶中央处切取4块0.5cm×0.5cm大小的全层皮肤组织块，均置入10%甲醛溶液中固定备用。

1.4 光镜观察

标本于60%、70%酒精脱水1小时（h），80%酒精脱水过夜，90%、95%、100%酒精脱水各1h，二甲苯透明两次各1h，常规浸腊两次各1h，石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，酒精梯度下行入水，自来水漂洗，苏木精染色5min，漂洗，1%稀氨水反蓝30秒，漂洗，伊红染色5min，漂洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5 表皮生长因子（Epidemal growth factor，egf）免疫组织化学染色

采用链霉卵白素-辣根过氧化物酶复合物（SP）法：石蜡切片常规脱蜡至水，PBS清洗3次，3%甲醇-双氧水室温下孵育5-10min，蒸馏水冲洗，PBS（PH7.4）缓冲液冲洗5min，枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复98℃20min。自然冷却至室温，PBS冲洗5min，滴加10%正常山羊血清封闭游离的结合位点，滴加1：75稀释的一抗EGF，4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，每次5min，滴加生物素标记的二抗IgG工作液，37℃水浴箱内孵育30min，PBS冲洗3次，每次2min，滴加辣根过氧化物酶HRP标记的链酶卵白素（三抗），37℃水浴箱孵育30min，PBS冲洗3次每次5mim。滴加DAB显色剂显色5min，自来水冲洗中止显色，苏木素复染2min，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明后封片，阴性对照用PBS替代一抗，余步骤同上。

1.6 结果分析

EGF阳性标准：EGF表达部位为胞浆胞核内棕黄色颗粒或黄褐色颗粒。在扩张皮瓣中EFG在表皮基底、毛囊及皮脂腺均有强烈表达，在血管内皮细胞及成纤维细胞也可见表达。采用计算机图像分析系统在400倍下，分析染色阳性细胞个数测定所占比例，以阳性细胞染色的积分光度值（OD值）来表示抗原表达量。阳性染色的积分光度越高，说明阳性细胞数量越多。采用SPSS11.5软件包进行统计学分析。多组计量资料采用多个样本均数比较的方差分析，多个样本均数间的多重比较采用q检验，以P

2 结果

2.1 一般情况

动物模型于术后30分钟缓慢苏醒，2小时后饮食正常。实验过程中无一例感染及并发症出现，均成活到预定观察时间。

2.2 HE染色组织学观察

E组：表皮层薄有2-3层细胞，真皮层内皮肤附件较密集，胶原纤维呈细束状，排列杂乱，可见小血管排列稀疏。

A组：维持期1周，表皮层薄细胞层数增加不明显，表皮细胞核大而圆排列较齐；层及网状层胶原排列成束，偶见断裂，裂隙较小。维持2周，真皮层及网状层胶原纤维偶见断裂，胶原纤维排列整齐。维持4周，扩张皮肤组织基本恢复正常，表皮厚度基本相似，表皮细胞较大整齐排列，皮肤附件间距增加，形态正常。维持6周与4周基本类似。

B组：维持期1周，表皮层增厚不明显，表皮细胞核相对较小排列不齐，胶原纤维可见大量断裂裂隙较小。维持2周，真皮层及网状层胶原纤维断裂较1周时减少。维持4周，表皮较薄细胞较小排列不齐，皮肤附件间距增加，形态正常。维持6周与4周类似。

C组：维持期1周，表皮层增厚，细胞层数增加不明显，表皮细胞核大而圆排列较整齐，层及网状层胶原纤维成条索状，胶原纤维可见断裂裂隙较小。维持2周，胶原断裂现象减少。维持4周，基本恢复正常，皮肤附件间距增加，形态正常。

D组：上皮增生不明显，组织学变现近似于E组。

2.3 EGF免疫组织化学结果

2.3.1 EGF定位与分布

EGF定位于胞浆胞核，表现为棕黄色颗粒或黄褐色颗粒，主要分布于表皮的基底层。扩张皮肤中EGF表达阳性的细胞较多且较密集，围绕基底层呈带状排列，而正常皮肤中EGF表达阳性细胞较少且散在。

2.3.2图像分析及统计学分析：在不同时间点，5组OD值分别为：

A组扩张皮肤中EGF的高表达在维持期保持在较高水平，并呈逐渐下降趋势，在维持6周时EGF的表达下降至正常。B组扩张皮肤组织中EGF的表达在维持前期（维持1、2周）保持在较高水平，在维持3周表现为急速下降趋势，在维持4周其表达再次升高，之后稳定在一定水平。C组扩张皮肤组织中EGF的高表达在维持期一直保持在较高水平。三种扩张形式之间比较：在维持1周，三组EGF的表达无显著性差异（P>0.05）；在维持2周A、B两组EGF的表达无显著性差异（P>0.05），但两组与C组有显著性差异（P>0.05）；在维持3周A组EGF表达与BC两组有显著性差异（P>0.05），BC两组间无显著性差异；在维持4周，三组EGF的表达无显著性差异（P>0.05）。

3 讨论

常规扩张方式是每周注入扩张器预制容量10-15%水1-2次，此法效果确切适用广泛但周期长并发症多。针对这些缺点很多学者发展出很多快速扩张方法：如单纯快速扩张、持续快速扩张、混合型快速扩张、超量快速扩张等。如何减少患者的痛苦并以较短的时间获得较多高质量的组织是目前的研究热点，也是皮肤扩张术研究的瓶颈。反复快速扩张其生物力学特性[3]包括应力松弛、断裂强度、蠕变特性等，其中应力松弛特性是在维持组织应力不变的情况下，应力随时间而下降的特性。经扩张后，皮肤软组织产生变形面积增加，之后扩张器的张力随着时间的延长而逐渐下降，可以接受下一次的继续扩张，不致造成局部缺血坏死。反复超量促使皮肤组织的应力松弛，扩张使皮肤发生蠕变、胶原纤维受应力刺激被拉长，增加扩张区皮肤面积；再次重复扩张区皮肤随上次扩张后局部面积增加而组织应力下降；三次扩张后剩余的维持液体对组织的应力明显降低。超量扩张-抽出后维持的方式，促使组织细胞内线粒体无氧酵解与有氧氧化的交替进行，增加细胞的代谢功能，细胞活性增强。扩张所致的反复一过性血流阻断，可启动毛细血管的自身调节机制，增加了毛细血管的开放数量及增生，减轻了缺血再灌注损伤。

3.1 反复快速扩张后皮瓣的组织学改变

研究表明，扩张后皮肤的组织学变化主要是[4-6]：①表皮层增厚，细胞层数增加。②真皮层变薄或变化不大，层及网状层含有大量胶原纤维，血管数量增加。③皮肤附件彼此分离，形态正常，皮下层明显萎缩，肌肉变化不大。④扩张器周围有包膜形成，包膜在扩张2-2.5月时最厚，且扩张后的变化情况与扩张器的大小、形状、扩张部位、扩张时间、患者性别年龄等因素无关。本实验发现：AC两组在不同维持期的组织学变现较接近，B组虽在维持期4周也可以观察到基本恢复，但之前见到大量的胶原纤维断裂且表皮层厚度增加不明显，表皮细胞核相对较小排列不齐。说明快速扩张造成较大的皮肤损伤，断裂胶原纤维的修复可能由再生性修复转化为瘢痕性修复而影响扩张皮瓣的质量。反复快速扩张由于对皮肤实施了预处理使之发生蠕变，增加了扩张区皮肤面积，维持量扩张时降低了扩张局部组织的应力，减少了扩张皮肤局部的损伤，可使皮肤得以快速再生性修复获得与常规方法类似的效果。

本研究未发现文献中提到的表皮层变薄，可能由于我们观察扩张后维持期的标本，未选择扩张后即刻观察，未观察到皮肤附件的彼此分离，但发现真皮层毛囊等皮肤附件间间距增加。由于皮肤组织胶原含量较高，标本组织固定时间过长，导致组织较脆；同时在组织切片制作过程中，标本脱水不彻底，包埋时浸蜡不充分；而毛囊、汗腺等组织由毛囊、汗腺细胞构成，故造成切片时由于组织松散出现皮肤附件分离、但形态正常。

3.2 EGF在扩张皮肤中的表达意义

表皮生长因子（Epidemal growth factor，EGF）是生物体内活性多肽[7]，广泛存在于造血系统以外的所有组织。其生物学作用包括：（1）促进成纤维细胞、上皮细胞的修复和血管内皮细胞等快速增值与分化，促进创面细胞迁移促进组织生长加快。（2）促进或抑制细胞的生长。（3）促进钾、钙、钠、氢离子的转运和交换，调节钙的代谢。（4）促进糖酵解及糖异生过程，促进脂肪形成。正常生理状态下组织EGF的表达较低水平，当细胞受到刺激时其释放增加，形成EGF-EGFR复合物直接参与启动和调控细胞增殖的基因，并编码与生长调控有关的重要蛋白基因从而发挥生物学效应。

皮肤组织受到扩张刺激后EGF合成与释放增加，三种扩张形式均可造成扩张皮肤组织EGF的高表达，A组扩张皮肤组织中EGF的高表达在维持期保持在较高水平，并呈逐渐下降趋势，在维持6周时EGF的表达下降至正常。B组EGF的表达在维持前期保持较高水平，在维持3周急速下降趋势，在维持4周再次升高，之后稳定在一定水平。分析认为，快速持续扩张形成的持续刺激导致细胞的延迟效应所致。可能原因：长期的缺血、缺氧导致细胞的代偿性活性增强，EGF合成、分泌增加，至维持期第3周时，失代偿后细胞凋亡，EGF合成分泌较少造成其表达在维持3周急速下降趋势。C组扩张皮肤组织中EGF高表达在维持期一直在较高水平。通过比较发现：维持期1周，三组的EGF表达无明显差异（P>0.05）；在维持期2周，AB两组的表达量较C组高（P

参考文献

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