GPR54及Kisspeptins在动物青春期启动中的作用
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摘要G蛋白偶联受体gpr54是新发现的视黄酸家族成员之一，kisspeptins是其内源性配体，两者均是动物体内的肽类物质，其在不同动物体内的分布区域有差异，但均与青春期启动密切相关。试验证明猪GPR54基因与下丘脑、垂体、卵巢发育性表达有关，GPR54系统在斜带石斑鱼性逆转过程中发挥作用，大鼠GPR54突变者性发育低下等。GPR54/Kisspeptins在调节动物体内促性腺激素LH和FSH的释放、促进生殖器官的发育及青春期启动中均具有重要的作用。
关键词GPR54；Kisspeptins；青春期启动；作用
中图分类号R335文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）11-0319-03
FunctionofGPR54andKisspeptinsinOnsetofAnimalPuberty
XU Lei
（College of Veterinary Medicine，Nanjing Agricultural University，Nanjing Jiangsu 210018）
AbstractGPR54（G-protein-coupled receptor 54）is one of new discovered RAR family，Kisspeptins is its endogenous ligand. They both are peptides in animals，and distribute into different areas，but both of them play important roles in the onset of puberty. Experiments indicated that genes of swines′ GPR54 have connection with development of hypogonadism，pituitary，ovary. GPR54/Kisspeptins play important roles in the course of the sex reverses for Epinephelus coioides. Sexual development of GPR54 mutations is low. Animal experiments indicated that GPR54/Kisspeptins play important roles in adjusting the release of gonadotropin LH and FSH，and promoting development of genitals and in the onset of puberty.
Key wordsGPR54；Kisspeptins；onset of puberty；function
动物青春发育是一个极为复杂的过程，受中枢神经系统调节、下丘脑―垂体―性腺（HPG）内分泌系统控制的过程。青春期启动和下丘脑促黄体激素释放激素（LHRH）脉冲增加并释放促性腺激素释放激素（GnRH）到下丘脑，一般发生在新生畜发育早期及畜禽发育晚期，然后被抑制直至青春期，因此青春期发育启动的关键是重新激活隐匿的GnRH释放神经元[1]。近年研究发现，Kisspeptins/GPR54系统可能是触发LHRH脉冲释放增加的关键因素，是动物青春期发育启动的分子阀门（gatekeeper）[2]。青春期发育是各种动物最重要的发育阶段，阐明青春期发育启动机制不仅可以解决动物生死发育的理论问题，而且为人类临床上早期诊断各种青春期疾病或发育障碍提供科学依据。
1GPR54概述
1.1GPR54受体的发现
GPR54为视黄酸家族G蛋白偶联受体，最初于1999年由Lee等从大鼠脑组织中克隆而来。2001年，Muir等[3]报道克隆了一个人的孤儿G蛋白偶联受体，命名为AXOR12或Hot7t175，GPR54受体与大鼠的孤儿受体GPR54同源性为81％，通过对基因组序列进行分析，人GPR54基因包含5个外显子，开放阅读框由190个碱基对组成，编码的蛋白质由398个氨基酸组成[4]。
1.2GPR54的组织表达及定位
最初，学者发现，在大鼠和人类的中枢神经系统和周围组织中GPR54都可以高表达。在大鼠大脑中几个区域中，GPR54 mRNA得以表达，其中以下丘脑表达最高。GPR54在大脑，尤其是下丘脑、边缘系统和基底节可表达，且表达量较丰富，同时也存在于垂体、胎盘、胰腺、脊髓、肝脏、心脏、胸腺、、肾脏、肺组织及肌肉。2009年，周春宝等利用原位杂交定位的方法在60日龄和初情期苏姜猪下丘脑中均发现GPR54 mRNA的阳性杂交信号主要集中在弓状核和腹内侧核中，其研究结果显示，各级卵泡中初情期成熟卵泡的阳性杂交信号最强，大卵泡的阳性率明显高于小卵泡。
2Kisspeptin概述
2.1KiSS-1基因的发现及定位
Kotani等在2001年寻找GPR54的内源性配体中发现，有分别含有54、14和13个氨基酸的多肽，其C端具有RF酰胺，是黑色素瘤细胞转移抑制基因KiSS-1的产物，命名为Kisspeptin，故分别含有54、14和13个氨基酸的多肽相应地分别为Kisspeptin-54、Kisspeptin-14和Kisspeptin-13。Kisspeptins的编码基因KiSS-1基因是一个新cDN段，具有肿瘤转移抑制作用，主要在大脑、胎盘及大脑室周边核、弓状核附近表达，且表达较为丰富[5]。
2.2Kisspeptin的结构
KiSS-1基因编码的亲水性蛋白氨基酸数量为145个，称为Kisspeptin（metastin），其半衰期可能较短，在体内可被furin蛋白酶及激素原水解为Kisspeptin-54，在质谱的分析过程及提取过程又被降解为Kisspeptin-13与Kisspeptin-14。其共同拥有的C末端RF-amide（Arg-Phe-N H2），是结合和激活G蛋白偶联受体（GPR）54的保守位点。
2.3Kisspeptin 的组织分布
Navarro等[6]从人的胎盘中提取多种KiSS-1衍生肽，该衍生肽对人和大鼠的相应受体均具有生物学作用，因此其总称为Kisspeptins。Harms等[7]通过Northern印迹（Northern-blot）法对心、肺、肝、胰腺、骨骼肌、膀胱上皮组织、肾、大脑及胎盘进行检测，发现这些部位KiSS-1 基因均有表达。近年来，人们还对猪、绵羊、猕猴、野鸭、石斑鱼等动物的Kisspeptin的分布定位进行了相应的研究。在猪中Kisspeptin分布主要集中在弓状核和腹内侧核中；绵羊KiSS-1表达细胞主要位于ARC，少数细胞位于视前区（POA）[8]；猕猴Kisspeptin神经元细胞仅位于下丘脑内侧基底部弓状核；Saldanha C J等（2010年）报道，野公鸭Kisspeptin细胞体仅位于视前内侧核（POM），纤维主要在视前内侧核、外侧隔核、腹侧海马、视顶盖分布密集。在斑马鱼中，Kisspeptin mRNA在间脑和中脑高表达，在后脑中等表达[9]。
3GPR54与Kisspeptin的生物学特性
3.1GPR54生物学特性
GPR54在1999年首先由大鼠体内发现，为孤儿G蛋白偶联受体，有7个跨膜结构域。大鼠的GPR54与甘丙肽受体（GALR）家族有较高的同源性。人的HOT7T175和AXOR12与大鼠的GPR54氨基酸的同源性为81％。牛蛙的GPR54（bfGPR54）cDNA编码379个氨基酸，bfGPR54与哺乳动物的GPR54氨基酸序列同源性为45％～46％，与鱼有70％～74％的同源性。Biran等[9]报道，斑马鱼KiSS1rb属于甘丙肽受体家族，与相关的甘丙肽受体同源性为45％。斑马鱼的KiSS1ra与其他鱼族的KiSS1r同源性为91％，但与哺乳动物的同源性为56％～58％。KiSS1rb与其他已知的鱼族的KiSS1r的同源性仅为60％，与哺乳动物的同源性为53％～56％。大鼠的GPR54基因定位于7 q11，小鼠的定位于10C1[10]。
3.2Kisspeptin生物学特性
Kisspeptin是KiSS-1基因编码的肽类激素。West等经过辐射杂交标记和荧光原位杂交技术分析，确定人KiSS-1基因定位于1q32区，其基因结构包括4个外显子和3个内含子。据报道，大鼠的KiSS-1基因定位于13q13，小鼠的定位于1E4[9]。在结构上，KiSS-1基因有分泌神经肽的特点，具有公认的信号肽序列，可分裂为点，包括酰胺化和分裂位点，可产生不同长度的酰胺化肽片段。Kisspeptins包括Kisspeptin-54（metastin）、Kisspeptin-14、Kisspeptin-13、Kisspeptin-10，它们和GPR54有相同的亲和力和效力。非洲蟾蜍属Kiss-peptin C端与鱼类的Kisspeptin-10氨基酸的同源性要比哺乳类的高[10]。Biran等[9]等报道，斑马鱼KiSS-1基因定位于11号染色体，由2个外显子和1个内含子组成，外显子1长115 bp，含有30个非编码碱基、翻译起始点和85个编码碱基。外显子2长487 bp，含有265个编码碱基、翻译终止密码和多聚腺苷化信号。内含子长1 168 bp。斑马鱼的KiSS-1cDNA蛋白质编码序列与负鼠和非洲蟾蜍属KiSS-1蛋白序列同源性为53％～65％，与哺乳动物KiSS-1蛋白序列同源性为37％～47％[11]。
4GPR54/Kisspeptins与青春期启动
4.1Kisspeptin和GPR54的青春期发育启动作用的发现
Funes等[12]在对GPR54靶向断裂的小鼠模型进行观察时发现，雄性和雌性小鼠在发育过程中，若缺乏GPR54，外生殖器均出现异常现象，且输精管、雄性、Leyding细胞等均发育不良，难以辨认其前列腺、生精小泡及包皮腺。而且在缺乏GPR54的情况下，雄鼠外生殖器比正常同龄大鼠小，同样，雌鼠内、外生殖器也存在比正常同龄大鼠偏小等现象，其乳腺的发育也不良。在观察过程中发现，雌性和雄性大鼠脊髓、甲状腺、垂体、大脑、胰腺、淋巴结及胃等部位并未发生明显改变。Navarro等[13]研究发现，在未成熟的雌性小鼠脑室内长期注入Kisspeptins，可使下丘脑脑―垂体―性腺轴的发育有所提前，如子宫重量的增加、阴道口的提前开放及血清中的促黄体生成素及雌二醇含量的升高等。另外，Navarro等还发现腹腔内及静脉注射也可产生相同效应。而且即使将内源性的促使分泌增加的如一氧化氮神经递质及兴奋哇氨基酸和途径阻断后，仍然存在分泌增强的效应[14]。另外其经过研究还发现，Kisspeptins也可对促卵泡生成素（FSH）发挥作用[6]。Gottsch等[15]经过研究，发现Kisspeptit1s在小鼠促性腺激素分泌过程中发挥作用，通过在其脑室内分别注入Kisspeptin-10和Kisspeptin-54，结果发现两者均可刺激促性腺激素的分泌。Irwig等[16]在将Kisspeptin-52注射到成年雄性小鼠的侧脑室后，也明显观察到血清LH水平有所升高（P
Shahab等[17]对无生殖腺的雄性幼猴自幼年期开始长期静脉给予人工合成的LHRH，结果发现其内源性LHRH分泌有所增加，通过对静脉或脑室快速给予Kisspeptin-10，结果LHRH分泌量明显增加。经过一系列的处理及运用聚合酶链反应检测，发现在雌性猴与雄性猴青春期其KiSS-1 mRNA的表达水平有所上升，特别是雌性猴下丘脑在青春期启动后GPR54 mRNA表达水平与青春期前进行比较，升高3倍以上；另外，通过杂交组织化学方法的应用发现，下丘脑弓状核附近KiSS-1和GPR54 mRNA的表达很强。
4.2Kisspeptin和GPR54对GnRH神经元的作用
根据KiSS-1 mRNA在下丘脑的表达，学者猜测在GnRH 分泌调节中，Kisspeptin-54可能发挥着重要的作用[15]。并且将GPR54转录产物定位在小鼠下丘脑的GnRH 神经元[16]，表明GnRH神经元可能是Kisspeptin直接作用的部位；同样GPR54在GnRH 神经元[18]进行定位也在一种热带鱼中被发现。在所有的研究中，尽管在-54-/-缺乏的小鼠中，正常促性腺激素的释放有所缺乏，但是垂体的功能依然完整，具备对外源性GnRH作出反应的能力。此外GPR54-/-小鼠下丘脑中，不会影响到GnRH肽的合成，因此可排除GPR54与GnRH合成直接相关的机制[19]，表明在啮齿类动物中，若其发生缺失突变及GPR54功能的紊乱，则中枢神经功能缺陷发生的原因是其性腺机能减退。
Kisspeptins可以对下丘脑GnRH进行刺激，以促使其分泌，但是由于垂体中GPR54表达水平较高，因此促进FSH和LH分泌不能排除是由Kisspeptin直接通过下丘脑垂体门脉系统对垂体进行刺激而产生的，但是因为Kisspeptin-54刺激LH分泌的能力较强，一般很低的浓度即可引起明显效应，而低浓度不能保证Kisspeptin-54注射后经扩散和稀释后依然有足够的浓度来刺激垂体分泌促性腺物质；而Kisspeptins 刺激FSH和LH分泌的作用被GnRH拮抗剂（acyline）阻止了 [14，16]；有研究发现在注射Kisspeptin-52后2 h， 86％GnRH神经元能够表达fos（立早基因）[16]；说明Kiss-peptin的作用是通过下丘脑GnRH神经元而发挥出的；另外，为了对促性腺激素的释放进行检测，在GPR54突变型和野生型小鼠内注入Kisspeptin，一段时间后在可监测范围内，突变型小鼠未发生明显反应，进一步说明Kisspeptin对促性腺激素发挥作用的惟一途径是通过GPR54受体，但是在大脑的其他区域，也存在GPR54 mRNA的表达，反映出Kisspeptin/GPR54信号很可能在其他的神经生理学机制中发挥作用。
Prentice等[20]长期给无生殖腺的雄性幼猴静脉注射人工合成的LHRH，结果表明其可以有效地促进内源性LHRH的分泌，后经过静脉内或脑室快速给予Kisspeptin-10，结果表明，LHRH分泌量也有明显的增加。运用PCR对卵巢未经处理的雌性猴及无性腺的雄性猴青春期前后下丘脑中的的RNA进行检测，结果发现在青春期雌性猴和雄性猴的KiSS-1 mRNA表达水平有所提高，尤其是对于雌性猴，其青春期启动后下丘脑中GPR54 mRNA表达水平与青春期前相比，可升高3倍以上。提示了动物青春期发育启动的关键环节可能是KiSS-1基因的激活。学者经过研究还发现，将Kiss-peptin注射给青春期前的母猪脑室内，使血浆LH和FSH的浓度有所增加；通过静脉注射，可使LH的浓度增加[21]。幼年恒河猴垂体对内源性GnRH释放的敏感性高，通过静脉注射或对侧脑室进行Kisspeptin-10的注射，发现可促使GnRH分泌的加强，引起LH的分泌，同样其可以被GnRH受体拮抗剂阻断。杂交组化显示GPR54mRNA和KiSS-1可以在下丘脑弓状核区实现高表达。这些研究结果与动物在幼年发育的晚期下丘脑配体GPR54信号可能被激活的假说相一致，可能二者对动物青春期脉冲式的GnRH释放起共同调节作用。
4.3GPR54及Kisspeptins在青春期启动中的作用机制
Messager等[21]进行小鼠下丘脑的研究。以对GPR54及其配体Kisspeptins的中枢作用方式进行观察，结果发现，GPR54和LHRH神经元共同存在于小鼠下丘脑，GPR54（-/-）小鼠的下丘脑LHRH神经元形态表现正常，其正中隆突较为密集时，在小鼠腹腔注入Kisspeptins后，可使GPR54（+/+）野生鼠体内LH和FSH分泌加强，直接在脑室注入Kiss-peptins后，可促使LHRH反应，进而释放出人脑脊液，同时血清中的LH水平随之上升。而对GPR54（-/-）小鼠进行同样的试验，其未表现出任何反应，但是外源性的促性腺激素释放激素可以引起GPR54（-/-）小鼠释放增加，这说明GPR54效应的发挥是通过Kisspeptins发挥的，且后者可能直接对下丘脑层面产生作用。研究人员将Kisspeptin-52注射入小鼠侧脑室后，对下丘脑进行免疫组织化学检查，结果发现，在注射Kisspeptin-52后2 h，LHRH神经元中的86％发生了共表达，而对照组不到1％的神经元发生了类似的表达。同时，通过原位杂交双标记法的运用，结果发现，77％的LHRH神经元可以共表达GPR54mRNA。而将Kisspeptins注入脑室所引起的前述效应则可由LHRH拮抗剂阻断。Plant等[22]研究发现，反复对处于青春期前的雄性猴静脉注入Kisspeptin-10，可以促使下丘脑中LHRH过早的持续性脉冲样释放，而Kisspeptin-10的这种效应可由LHRH拮抗剂阻断。这些研究结果都表明，Kisspeptins可能是通过下丘脑LHRH系统而发挥作用。
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