樟芝深层液体发酵条件的试验研究

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摘要：目的研究提高樟芝菌丝体干重和胞内外多糖产量的方法。方法用二次通用旋转组合设计法，研究樟芝液体发酵条件中的温度、转速和接种量对菌丝体干重和胞内外多糖产量的影响。结果与结论胞内多糖总产量的最优参数组合为温度27 ℃、转速113 r/min、接种量21 %；胞外多糖产量的最优参数组合为温度27 ℃、转速120 r/min、接种量22 %，并通过试验验证了最优组合。

关键词：樟芝；液体发酵；菌丝体；多糖

中图分类号：R977.6文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)09-0018-04

Experiment Study on Submerged Fermentation Condition of Antrodia Camphorata

ZHANG Hong-hai1, ZHANG Zhong-xin1, MA Hai-le2*

(1. Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003, China; 2. Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Abstract：Objective To study the methods of increasing the dry mycelium weight and the yield of polysaccharide in intra-cell and extra-cell of Antrodia camphorata. Methods The influences of temperature, centrifugal speed and inoculation volume on dry mycelium weight and yield of polysaccharide were investigated in the submerged fermentation of Antrodia Camphorata by means of the method of quadratic general rotary unitized design. Results and Conclusion The optimal combination of parameters for the total yield of intracellular polysaccharide is regarded as temperature of 27 ℃, centrifugal speed of 113 r/min, inoculation volume of 21 % and that of extracellular polysaccharide is the temperature of 27 ℃, centrifugal speed of 120 r/min, inoculation volume of 22 %. The both of optimal combinations are validated.

Key words：Antrodia camphorata; liquid fermentation; mycelia; polysaccharide

樟芝（Antrodia camphorata）生长在中国台湾牛樟树的中空心木材内壁，故称为牛樟芝，也叫樟窟内菇，属担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，薄孔菌属[1,2]。樟芝具有保肝、解毒消肿、抗肿瘤、提高免疫力等功效，是一种珍稀名贵、有开发潜力和药用价值的真菌[3,4]。研究表明，樟芝多糖能提高免疫力和抑制肿瘤细胞增生，无副作用。为了提高樟芝发酵过程中胞内外多糖的产量，我们用二次通用旋转组合设计法[5,6]优化了影响樟芝菌丝体生长和胞内外多糖产量的发酵条件。

1材料与方法

1.1菌种

樟芝（上海农科院食用菌研究所提供）。

1.2培养基

1.2.1斜面培养基PDA培养基。

1.2.2液体种子培养基PDA液体培养基加入0.1 %KH2PO4和0.05 %MgSO4・H2O。

1.2.3液体发酵培养基玉米面5 %，麸皮0.6 %，维生素B1 0.012 %，KH2PO4 0.25 %，MgSO4・7H2O 0.05 %。

1.3培养方法

1.3.1液体种子的培养取斜面试管菌种接种于培养皿中，25 ℃培养20 d，菌丝体粗壮后，用直径8 mm无菌打孔器从平板上打孔取块，定量接种于含有100 mL培养基的250 mL三角瓶中，于25 ℃、130 r/min摇床上培养8 d。

1.3.2发酵培养250 mL三角瓶内装100 mL培养基，接种后在摇床上震荡培养。

1.4菌丝体干重测定、胞内外多糖提取和含量测定

1.4.1菌丝体干重测定发酵结束后，4 000 r/min离心15 min，沉淀后120目滤网过滤获菌丝体，用蒸馏水洗涤数次，50 ℃烘干至恒重，电子天平称量。

1.4.2胞内多糖测定研钵充分研磨干燥的菌丝体，过120目筛后，置于圆底烧瓶中，加20倍水，80 ℃水浴提取胞内多糖2次，每次1 h。然后用超声波提取，每次30 min，合并提取液，离心分离、过滤，除去滤渣，用硫酸-苯酚法测定多糖含量。

1.4.3胞外多糖测定取100 mL过滤后的发酵液，用旋转蒸发仪在60 ℃下将发酵液浓缩至1/3，加3倍无水乙醇沉淀24 h，4 000 r/min离心15 min，用无水乙醇洗涤沉淀，置于50 ℃烘箱中烘干至恒重，得胞外多糖。

1.5试验方法

发酵条件和胞内外多糖试验采用三因子二次通用旋转组合设计法，因素编码见表1。

2结果与分析

2.1建立发酵条件优化数学模型

采用三因子二次通用旋转设计对樟芝的发酵条件和胞内外多糖进行试验研究，其试验方案及结果见表2。

统计分析试验结果得到影响菌丝体干重、胞内多糖总产量和胞外多糖产量的回归方程。

式中X1=(Z1-27)/3，X2=(Z2-125)/15，X3=(Z3-15)/6，Z1，Z2，Z3分别是试验温度、转速、接种量的实际值。代换回归方程(1)、(2)和(3)，得各参数对各指标的回归方程为：2.1.1拟合不足和回归方程显著性检验为进一步分析回归方程(1)、(2)、(3)，对所得回归模型进行方差分析，回归方程检验见表3。由表3可见，方程(1)、(2) 、(3) 在α=0.01水平上不失拟，表明未知干扰因子对试验结果干扰很小；回归方程在α=0.01水平上显著，表明方程与实际情况拟合很好，方程回归显著。

2.2各参数对指标影响规律的分析

利用菌丝体干重、胞内多糖总产量、胞外多糖产量与各参数的回归方程(4)、(5)、(6)，固定2个参数在0水平的值，分别求第3因素与它们的降维回归方程，根据这些方程得到3个因子对它们影响的关系曲线。

2.2.1 各参数对菌丝体干重的影响 见图1。

由图1可见，菌丝体干重随温度的升高逐渐增加，28.5 ℃时菌丝体干重最大。温度继续升高则菌丝体干重下降，表明温度适宜有利于菌丝体生长；转速增加供氧量增大，有利于菌丝体生长，转速达到125 r/min后，继续增高转速，供氧量太大，反而抑制了菌丝体生长；接种量对菌丝体干重影响最大，接种量少时，菌丝体后期虽有增长潜力，但是，前期生长的菌丝体不断老化、自溶，因此菌丝体干重低；当达到最大值后再增大接种量，干重逐渐减少。

2.2.2各参数对胞内多糖总产量的影响见图2。

由图2可见，温度22～27 ℃范围内，胞内多糖总量随温度升高而增加；超过27 ℃后，随温度增加而减少，表明适宜的温度有利于胞内多糖积累；随着转速提高，胞内多糖总量先升后降，可能高的转速破坏了菌丝体，不利于胞内多糖积累；接种量5 %～21 %范围内，胞内多糖总量显著增加，然后逐渐减少，表明适宜的接种量有利于胞内多糖总量增加。

2.2.3各参数对胞外多糖的影响见图3。

由图3可见，胞外多糖产量随温度升高先升后降，28 ℃时胞外多糖产量最高，温度太高不利于胞外多糖的积累；转速提高能增加胞外多糖积累，超过120 r/min时，胞外多糖产量反而逐渐减少；胞外多糖产量随着接种量的增加先升后降，接种量21 %时胞外多糖产量最高。

2.3发酵条件的最佳组合

利用回归方程进行参数优化，寻求温度、转速、接种量取何值时，菌丝体干重、胞内多糖总含量和胞外多糖产量最佳。优化计算采用复合形法。优化的目标函数采用回归方程(1)、(2)、(3)，约束条件为－1.682＜Xi＜1.682，i= 1,2,3。经优化计算得出最佳组合，再利用代换将其转化为各参数的实际值。发酵菌丝体的最优组合为：温度29 ℃，转速113 r/min，接种量20 %，理论值为6.1 g/L；发酵胞内多糖的最优组合为27 ℃，转速113 r/min，接种量21 %，理论值为0.88 g/L；发酵胞外多糖的最优组合为27 ℃，转速120 r/min，接种量22 %，理论值为0.97 g/L。发酵菌丝体、胞内外多糖的最优组合分别通过3次试验验证，平均后得出的结果是：菌丝体干重6.18 g/L，胞内多糖0.89 g/L，胞外多糖0.96 g/L。

3结论

（1）建立了菌丝体干重、胞内多糖总产量、胞外多糖产量的回归方程，方差分析表明方程显著，拟合很好。

（2）得到了温度、转速和接种量对菌丝体干重、胞内多糖总产量和胞外多糖产量的影响规律。

（3）得出了发酵菌丝体的最优组合为：温度29 ℃，转速113 r/min，接种量20 %，理论值为6.1 g/L；发酵胞内多糖的最优组合为27 ℃，转速113 r/min，接种量21 %，理论值为0.88 g/L；发酵胞外多糖的最优组合为27 ℃，转速120 r/min，接种量22 %，理论值为0.97 g/L。并通过验证试验得以证实。

参考文献

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