大剂量尿激酶溶凝的量效时效及安全性的初步研究
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【摘要】 目的 探讨尿激酶溶解血凝块的最佳用药剂量、用药时机及药物最佳作用时间，为临床一次性清除血肿提供实验依据。方法 采用2个（4×4）拉丁方设计，分析UK剂量［(1万U/ml、2万U/ml、3万U/ml、4万U/ml)］、用药时机(抽血后2、4、8、16 h)和药物作用时间(加UK后2、4、8、16 h)对溶凝效果的影响。制备家兔脑内血肿模型，对比观察不同剂量尿激酶(10 000 U vs 30 000 U)及等量生理盐水对脑组织形态学的影响。结果 UK剂量对溶凝体积的差异有统计学意义(F=9．58，P=0．010 5)，尿激酶10 000 U组的溶凝体积明显低于20 000 U组、30 000 U组或40 000 U组，而后3组间的差异无统计学意义。用药时机和药物作用时间对溶凝体积的差异均无统计学意义(F=1．83，P=0．242 3；F=2．39,P=0．167 3)。光学显微镜和电子显微镜结果显示，3组标本均出现脑出血后急性期的形态学改变，未见其他的细胞形态和超微结构方面的异常改变。结论 UK剂量是影响溶凝效果的关键因素，20 000~30 000 U/ml的UK为最佳安全剂量。延迟16 h用药不影响溶凝效果，UK作用2 h足以发挥溶凝效用。
Preliminary study ofdose-time-effect of clot lysisand its safety with a large dose urokinase in vitro
WANG Cheng-dong,WU Li-li,WANG Yong-he,et al.Department of Center Laboratory,Weifang Peoples Hospital,Weifang 261041,China
【Abstract】 Objective To explore the optimal dose and time for clot lysis with urokinase for further providing experimental basis for the complete resolution of intracerebral solidhematoma one-off.
Methods According to the 4×4 Latin Square design,lytic efficacy was assessed in UK dose［(10 000 U/ml,20 000 U/ml,30 000 U/ml or 40 000 U/ml)］and the timing of Uk infusion(2,4,8,16 h after blood sample taken)and UK lytic time(2，4，8,16 h after UK infusion)in vitro.15 rabbits were subjected to the intracerebral hematoma model for analysing the effect of 2 differents UK dose(10 000 U vs 30 000 U)on brain tissue around hematoma cavity.Results Significant difference(F=9．58，P=0．010 5)of lytic efficacy of UK was noted with UK different dose treatment series,and lytic volume(101．25 μl)was significantly decreased with 10 000 U/ml UK treatment compared with other three series(233．50,237．25,317．25 μl),but no significant difference was found among the three or in UK infusion timing(F=1．83，P=0．2423)or lytic time(F=2．39,P=0．167 3).The results in morphology showed pathological changes on acute phase of cerebral hemorrhage,some abnormal changes in cell shape and ultrastructure such as degeneration or necrosis were not observed.Conclusion The results suggest that UK dose is the key for lytic efficacy,and the optimal and safe dose of UK required to lyse 1 ml of clotted blood would be 20 000-30 000 U/ml.Delaying therapy of up to 16 hours does not significantly compromise its efficacy，and 2 hours are quite sufficient for receiving good lytic efficacy with UK treatment.
【Key words】Large dose urokinase; Clot lysis；Rabbits; Dose-time effect
在脑出血的外科治疗中，传统的尿激酶(urokinase,UK)溶解引流术是尽快清除血肿、改善患者预后的有效方法，但治疗效果仍然不甚令人满意，其主要原因之一是对UK溶凝的量效与时效知之甚少[1]。笔者对尿激酶溶解血肿较佳的用药时机、用药剂量、药物作用时间及用药安全性等问题进行研究，现报告如下。
1 材料与方法
1．1 UK来源 UK为北京赛生药业有限公司产品，为冻干品，用0．9%灭菌生理盐水配成10 000、20 000、30 000、40 000 U/ml溶液。即用即配。
1．2 血凝块制备 试验血凝块来自我院神经外科高血压脑出血患者。术前静脉抽血20 ml，每管1 ml分装， 立即置于37℃水浴中温育2~16 h。按用药时机(抽血后2、4、8、16 h)分为4组，每组5支试管，1支为对照管，另外4支为试验管。
1．3 实验方法 根据2个（4×4）拉丁方设计，分别于抽血后2、4、8、16 h，注入1 ml浓度为10 000、20 000、30 000、40 000 U/ml的UK溶液(试验管)或等体积0．9%灭菌生理盐水(对照管)，再分别于加酶后2、4、8、16 h测定试验管血凝块体积(μl)。对照管与试验管血凝块体积的差值为UK溶凝体积，其值越大，溶凝效果越好。血凝块体积测量参考“血块收缩试验”，将血凝块取出后，用数字可调式移液器精确测量残留液体积，间接计算血凝块体积。
1．4 动物选择及分组 选择家兔15只(由潍坊市人民医院动物实验中心提供)，体质量1 920~2 750 g，随机分为A、B、C 3组，A组(5只)为每毫升血肿注入尿激酶10 000 U组；B组(5只)为每毫升血肿注入尿激酶30 000 U组；C组(5只)为每毫升血肿注入等量生理盐水组(对照组)。
1．5 脑内血肿动物模型制备及标本取材 将家兔固定于手术架上，腹腔内注射氯胺酮(200 mg/kg)，麻醉成功后，头顶部备皮，取过中线的弧形切口直达颅骨，暴露颅骨2．5 cm×2．5 cm大小，用高速磨钻及鞍底咬骨钳在前囟外侧形成1．5 cm×1．5 cm大小骨窗，显微剪刀将硬膜打开，无菌空针抽取兔自体全血1 ml，垂直刺入脑内约1 cm，注入血液，留针头于局部，再抽取不同浓度尿激酶溶液0．5 ml(实验组)及等体积生理盐水(对照组)，分别注入实验兔脑内，拔出针头，脑表面贴小片明胶海绵，以防液体自皮层外漏，缝合硬脑膜及头皮。2 h后再次注入氯胺酮于腹腔内加强麻醉，拆开头皮缝线，显露硬脑膜，显微剪刀将打开，顺穿刺伤道到达血肿腔将脑组织分开，于血肿腔周围近中线处取脑组织0．3 cm×0．3 cm×0．3 cm大小2块，行常规病理和电子显微镜检查。
1．6 统计方法 经SAS软件处理，采用拉丁方分析，P
2 结果
2．1 16个血液标本37℃温育2~16 h均完全凝固，并析出血清。加入UK后血凝块体积均有不同程度的改变(见表1)。拉丁方分析结果显示，不同UK剂量对溶凝体积的差异有统计学意义(F=9．58，P=0．010 5)。进一步的SNK-q检验结果显示，10 000 U组溶凝体积(101．25 μl)与20 000 U组(237．75 μl)、30 000 U组(233．50 μl)或40 000 U组(317．25 μl)的差异均有统计学意义，而20 000U、30 000 U、40 000 U组间的差异无统计学意义。用药时机和UK溶凝时间对溶凝体积的差异均无统计学意义(F=1．83，P=0．2423；F=2．39,P=0．167 3)。
2．2 动物行为 所有动物在实验完成后均能正常苏醒，24 h内恢复正常，存活6个月无任何异常情况。
2．3 脑组织形态学改变 光学显微镜下组织学分析3组均见血肿病灶周围脑组织染色浅淡，组织机构疏松，细胞间隙增大，毛细血管扩张充血，血管间隙不同程度扩大，血管周围可见红细胞漏出改变。偶有单核细胞渗出。星形细胞轻度肿胀，未见有脱色，无细胞核固缩偏位的改变。透射电子显微镜观察所见，神经元核仁明显，核染色质呈粗颗粒状或/和斑块状(见图1)，线粒体成空泡样改变(见图2)，部分线粒体嵴断裂(见图3），粗面内质网不同程度扩张(见图4)。胶质细胞核染色质呈粗颗粒状(图5)。核膜局部消失，线粒体也呈空泡样变，有的线粒体嵴断裂现象出现。有的细胞质有抽提现象(见图6)。
3 讨论
目前有关尿激酶溶解引流颅内血肿的用药剂量和用药方法尚无统一标准，大多数是凭经验用药。虽然能收到一定疗效，但治疗效果仍然不甚令人满意。特别是不能将血肿一次性彻底清除，给临床带来诸多弊端。是否与用药剂量、用药时机以及药物作用时间不适当有关，目前少见报道。如能适时适量地应用UK溶解血肿则疗效更为显著。
血凝块溶解的关键是足量内源性或外源性纤溶酶原激活物将PLG转变为PL。UK作为一种直接的外源性PLG激活剂，有较强的溶解血肿作用，其溶解活性与其浓度成比例，可以根据血肿体积和所需的溶解速度选择UK用量[2]。本实验结果亦表明UK剂量是影响其溶凝效果的主要因素。同时，UK具有酶促反应动力学特点，本实验中UK浓度从10 000 U/ml增至20 000 U/ml时明显加速了血凝块的溶解，进一步增加UK至30 000 U/ml或40 000 U/ml，血凝块溶解效果并无明显改变。此外，UK溶凝有一定的时限性。这是因为:①UK半衰期短，为8~10 min，故UK作用时间不宜过长。考虑到早期清除血肿的重要性，应在UK作用2~16 h内尽早放开引流管。进一步研究短时(
值得注意的是，本实验中即使有足量UK，血的凝块仍然没有完全溶解；而笔者根据实验结果在临床中治疗部分患者均取得了理想的效果，多数患者能一次性将血肿彻底清除[6]。这种差异可能与体外实验缺乏纤溶酶原及其相关成分的再补充有关。
临床实际工作中应用UK溶解引流血肿时往往采用少量多次的方法，尿激酶用量从5 000~50 000 U[7,8]。本实验中UK溶凝的最佳剂量(20 000~30 000 U/ml血肿)远远超过了文献报道的UK剂量。为了解其安全性，本文对3组颅内血肿动物模型进行脑组织形态学比较研究。光学显微镜下HE染色显示脑组织结构疏松，细胞间隙增大，毛细血管间隙扩大，血管扩张，这与文献报告[9]脑出血后脑组织轻度水肿病理改变相一致。电子显微镜下显示胶质细胞质有抽提现象，胞浆内有数量不等水肿液。神经细胞膜结构完整，线粒体肿胀，嵴减少，粗面内质网扩张，亦符合早期水肿改变并无因用药导致的细胞胞体破裂，细胞核固缩，细胞坏死等现象，证实UK大剂量(30 000 U/ml血肿)应用是安全的，无明显毒副作用。在我们初步的临床应用中证实了该剂量能明显减少用药次数，能显著提高疗效。进一步的远期随访研究是有必要的。
参考文献
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