高原环境下REM睡眠剥夺大鼠皮质GRP78的表达及药物干预

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摘要：目的探讨高原环境下大鼠不同时间快速动眼睡眠（rem）期睡眠剥夺（SD）后皮层内质网应激（ERS）标志性分子葡萄糖调控蛋白78（GRP78）的动态变化、神经元凋亡影响及人参皂甙Rd（GS Rd）可能的神经保护作用。方法采用小平台水环境法制作大鼠SD模型，应用免疫组织化学染色检测相关时间点GRP78的动态变化；TUNEL试剂盒检测凋亡细胞。结果在平原（兰州）组，SD后1 d皮层区GRP78蛋白表达开始增高，3 d时达高峰，5 d时与正常睡眠组相比无明显差别。GS Rd，组SD后1 d、3 d、5 d GRP78的表达较生理盐水对照组增高。在对应时间点高原（可可西里）组GRP78的表达均高于平原组。结论高原SD组大鼠GRP78的表达较平原组增高；GS Rd能够提高SD组大鼠GRP78表达；GS Rd可能会通过升高GRP78的表达保护内质网功能，以减轻脑损伤。

关键词：高原 睡眠剥夺 葡萄糖调控蛋白78 皮层 人参皂甙Rd

中图分类号：R741文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0591-02

Expression of GRP78 in Rats with Sleep Deprivation during High-altitude Environment and Intervention

Ma Yajie，Yang Jinsheng，Yang Xiao，et al

The Second Clinical Medical College，Lanzhou University(Lanzhou 730050)

Abstract:ObjectiveTo investigate the dynamic expression of endoplasmic reticulum stress（ERS）GRP78，neuron apoptosis in the rat cerebral contex at different stages of REM sleep deprivation in high altitude environment，and the possible neural protective effect of ginsenoside Rd.MethodsThe sleep deprivation of Wistar rats was induced by employing“flower pot”technique.Expression of GRP78 protein was check with immunohistochemistry staining.Apoptosis cell was studied with TUNEL.ResultsImmunohistochemistry staining results showed that the expressions of GRP78 protein was increased after one day of REM sleep deprivation compared with that in rats with normal sleep in plain group（Lanzhou group） and reached the highest on the normal sleep group.After intervention of ginsenoside Rd，the expression of GRP78 was higher than physiological saline groups after first or third day of REM sleep deprivation.The expression of GRP78 protein was not different from physiological saline groups on the fifth day.At the same time the expression of GRP78 protein in plateau group（Kekexili group） was higher compared with plain group.ConclusionThe expression of GRP78 protein was higher in plateau compared with plain groups.Ginsenoside Rd could increase expression of GRP78 protein.Ginsenoside Rd might lessen brain injuries by increasing expression of GRP78.

Key words:plateau；sleep deprivation；GRP78；cerebral contex；ginsenoside Rd

葡萄糖调控蛋白（glucose regulated protein 78kD,GRP78）又名免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip），属于热休克蛋白70家族的成员［1］，主要存在于细胞内质网中，通过阻止内质网中新生肽聚集、调节内质网钙稳态、抗内质网相关性细胞凋亡等作用，发挥内质网保护功能［2,3］。人参皂甙Rd（GS Rd）是人参的主要有效成分，具有抗凋亡、神经保护作用，已经进入临床三期试验。本实验观察高原环境下GS Rd干预组SD大鼠皮层GRP78表达的变化,探讨GS Rd对SD损伤大鼠的可能神经保护机制。

1材料与方法

1.1实验动物及主要试剂成年Wistar大鼠70只，雌雄各半，体重180 g~300 g，由甘肃省中医学院动物实验中心提供。GRP78一抗、二抗，由北京博奥森科技公司提供，TUNEL试剂盒，购自Roche公司。

1.2动物模型的建立采用小平台水环境法建立SD模型，参照相关文献制作剥夺箱体积为30×30×30 cm3，中央置一直径为6.5 m，高8 cm的平台。若大鼠进入快速动眼（REM）睡眠,则由于肌肉张力松弛而落入水中,并迅速爬上平台，不断重复此过程造成REM的剥夺。正常对照组单独笼养,适应环境1周。

1.3动物分组与给药70只大鼠随机分为两组，平原组（兰州组）和高原组（可可西里组）。每组又分正常睡眠组GS Rd干预组（GS Rd 1 d、3 d、5 d）和生理盐水对照组（NS1 d、3 d、5 d）。剔除溺水和意外死亡后随机补充以满足每个时间点为5只大鼠。GS Rd由广东泰禾生物药业有限公司提供（每支10 mg），GS Rd组大鼠于实验开始前7 d腹腔注射GS Rd（2 mg/kg ），1次/天。相应对照组予以等剂量生理盐水腹腔注射。

1.4HE染色脑标本放入4%多聚甲醛中固定24 h，对大脑皮层组织进行脱水、 透明、 浸蜡、 包埋、 切片。

1.5免疫组织化学染色采用SABC法，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；用DPcontroller 70/OlympusBX61显微摄影分析系统进行图像采集（由甘肃农业大学分析测试中心协助完成），光镜下于每一张切片随机取5个视野采集图像。免疫组化图像采用Image-Pro plus 6.0分析软件进行分析，测量每个视野的阳性细胞数，取算术平均数作为该例的阳性细胞数。

1.6凋亡细胞检测经北京中科通用医学图像分析系统(GMIAS2.0)处理，每只大鼠选取5张切片，每片随机取3个视野，以阳性染色细胞数进行统计分析。

1.7统计学处理计量资料以均数±标准差（x±s）表示，计数资料采用χ2检验，采用t检验、用方差分析。SPSS11.0软件分析。

2结果

2.1HE染色光镜下可见，兰州组正常睡眠组大鼠皮层细胞排列整齐，胞浆丰富，核呈圆形，居中。高可可西里组正常睡眠组大鼠皮层细胞排列稍紊乱，细胞轮廓稍模糊。SD组大鼠皮层区脑组织疏松淡然，结构排列紊乱，数目减少，体积变小，胞质浓缩，胞核固缩；GS Rd干预组神经元数目增多，细胞轮廓较清晰。

2.2免疫组织化学染色GRP78免疫反应阳性产物表现为棕黄色颗粒，分布于胞浆及胞核。兰州生理盐水对照组SD1 d后GRP78表达开始增多(P

2.3TUNEL染色兰州组大鼠SD1 d、3 d皮质区可见凋亡细胞，核呈棕黄色颗粒；在SD5 d、GS Rd预先干预组及正常睡眠组均未见明显阳性细胞。SD后1 d、3 d皮质区细胞凋亡分别为(19.10±1.87、22.50±2.01)，SD1 d、3 d皮质区细胞凋亡数和正常睡眠组同区相比有统计学意义(P

3讨论

grp78位于内质网上，是内质网应激的特异性标志。当组织发生缺血、缺氧、细胞代谢紊乱时，导致GRP78大量表达，足量表达的GRP78，与细胞内未折叠或错误折叠的蛋白结合，通过恢复内质网功能，保证应激情况下蛋白合成，维持机体内环境稳定［4,5］。

SD可以引起内质网应激，长期SD可造成神经细胞内质网发生结构改变［6］，发生细胞凋亡，导致神经元的损伤。细胞凋亡是SD导致神经元损伤死亡的一种重要形式。通过某些药物干预细胞凋亡通路，可以使神经元细胞免受损伤，为此，选择中药GS Rd进行了实验性研究。

GS Rd是从中药人参、三七中提取的化合物，其通透性高，可以透过血脑屏障。GS Rd具有抗肿瘤［7］、抗变态反应［8］、抗骨质疏松［9］等多种生物学效应。本研究主要探讨GS Rd的神经保护作用。本实验选择2 mg/kg为给药剂量，每日给药1次，连续用药7 d，给药完毕后即进行SD。

本实验免疫组化结果显示，兰州组SD1d后大鼠的皮层区GRP78表达开始升高，提示SD引起细胞发生了内质网应激。随着SD时间的延长，GRP78表达逐渐增高，至第3天达高峰，此时未折叠蛋白反应能力最强，细胞由自身调节逐渐转向凋亡，TUNEL染色可见SD3 d 时凋亡细胞最多，也与免疫组化相一致。至SD5d GRP78的表达较正常睡眠组相比未见明显差异，可能与此时细胞内质网发生蛋白合成功能障碍有关。可可西里SD组GRP78的表达较兰州组增高，表明在缺氧、强辐射等高原暴露因素的参与下，加剧了内质网应激反应。药物GS Rd干预组大鼠GRP78的表达水平较生理盐水组增加，GS Rd可能是通过促进GRP78的表达来发挥保护内质网功能，减轻SD造成的脑损伤，可以为具有一定可预见性的脑损伤保护提供一个新的选择。

SD后神经细胞凋亡,涉及Ca2+超载、能量衰竭、自由基释放、线粒体损伤、兴奋性氨基酸毒性作用等。GS Rd是一种非特异性Ca2+通道阻断剂，能非选择性阻断受体依赖性Ca2+通道开放，抑制胞外Ca2+内流和胞浆Ca2+升高，抑制Na+-Ca2+交换，防止胞内Ca2+超载。另外GS Rd具有抗氧化损伤、抗辐射、调节免疫，扩张血管、改善微循环、促进血管内皮细胞功能恢复、调节血管活性物质等多种药理作用，也可能参与低氧及SD后脑损伤的保护作用。

参考文献:

［1］Daugaard M,Rohde M,Jaattela M,et al.The heat shock protein70 family:Highly homologous proteins with overlapping and distinct functions［Ｊ］.FEBS Lett,2007,581:3702-3710.

［2］Lamb HK,Mee C,Xu W,et al.The affinity of a major Ca2+ binding site on GRP78 is differentially enhanced by ADP and ATP［Ｊ］.Biol Chem,2006,281:8796-8805 .

［3］Nouhi Z,Chevillard G,Derjuga A,et al.Endoplasmic reticulum association and N-linked glycosylation of the human Nrf3 transcription factor［Ｊ］.FEBS Lett,2007,581:5401-5406.

［4］Degracia DJ,Montie HL.Cerebral ischemia and the unfolded protein response［Ｊ］.J Neurochem,2004,91(1):1-8.

［5］Schneeloch E,Wenkel S,Mies G,et al.Spreading depression activates unfolded protein response.［Ｊ］.Neurosci Lett,2004,368(1):37-40.

［6］Malhotra JD,Kaufman RJ.The endoplasmic reticulum and the unfolded protein response［Ｊ］.Semin Cell Dev Biol,2007,18(6):716-731.

［7］Yang ZG，Sun HX，Ye YP.Ginsenoside Rd from panax notoginseng is cytotoxic towards HeLa cancer cells and induces apoptosis［Ｊ］.Chem Biodivers,2006,3(2):187-197.

［8］Choo MK，Park EK，Han MJ，et al.Antiallergic activity of ginseng and its ginsenosides ［Ｊ］.Planta Med，2003，69（6）:518-522.

作者简介：马亚杰(1982―)，男，硕士研究生，现工作于兰州大学第二临床医学院（邮编：730050）；杨金升、石向群、郑佳丽、刘学娟，工作于兰州总医院；杨晓，工作于郑州大学第二附属医院。

(收稿日期：2011-01-10）