单因素方差分析优化桂枝茯苓胶囊中苦杏仁苷浸出率

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摘 要：目的：优化乙醇对桂枝茯苓胶囊苦杏仁苷的浸出率。方法：以苦杏仁苷浸率为考核指标，单因素方差分析最佳浸出苦杏仁苷乙醇浓度。用不同浓度乙醇处理桂枝茯苓胶囊，高效液相色谱法测定各乙醇处理液中苦杏仁苷的浓度。色谱柱:(4.6mm ID×150mm,粒径5μm);流动相:甲醇和0.2%磷酸水(24∶ 76)；检测波长:210nm;流速mL.min-1;柱温:室温;进样量15μL。结果：苦杏仁苷在0.3125～3.125μg范围内线性关系良好(r=0.9999),(n=6), 60％乙醇对苦杏仁苷浸出率最高。结论：该方法重现性好,可作为桂枝茯苓胶囊乙醇浸出苦杏仁苷的简便方法。

关键词：桂枝茯苓胶囊; HPLC法；单因素方差分析；苦杏仁苷

中图分类号：R283文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2700-02

One–Way ANOVA Optimizing the Extract Technology of Amygdaloside in GZFL Capsules

WANG hongyin1,HUANG Yanfen2

(1.People’s Hospital of Lanxi,Lanxi 320000，Zhejiang,China；

2.Life Science Institute，Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053, Zhejiang,China)

Abstract:Objective:To optimize the extract technology of amygdaloside in GZFL capsules.Methods:Take amygdaloside content in extract as observation index, One Way ANOVA was used to study the factor of concentration of ethanol to extract amygdaloside in GZFL capsules. GZFL was treated with deferent concentration ethanol. Amygdaloside was determinated by HPLC. The column was Hypersil C18 (4.6 mm 150mm, 5(m). The mobile phase consisted of methanol and 0.2% phosphoric acid (24∶ 76) at a flow rate of 1mL.min-1. The detection wavelength was 210nm. Results: Amygdaloside had a good linearity in the range of 0.3125-3.125μg (r=0.9999). The average recovery was 99.9%, RSD=0.36%.60％ ethanol is the most suitable to extract Amygdaloside in GZFL capsules. Conclusion: The method is convenient, accurate, and has good reproducibility. It can be used to extract Amygdaloside in GZFL capsules.

Key words:GZFL Capsules;Amygdaloside;HPLC

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收稿日期：2011-07-23

基金项目：浙江省教育厅基金资助项目(20060721)

作者简介：王红英（1973－），女，浙江兰溪人，副主任中药师，学士，研究方向：医院药学。

通讯作者：黄燕芬(1974-),女，浙江金华人，副教授，研究方向：中药成分的分离与含量测定。桂枝茯苓胶囊组方源于东汉张仲景的《金匮要略》,由桂枝、茯苓、赤芍、牡丹皮、桃仁五味中草药组成,功效为活血化淤、缓消症块,其中苦杏仁苷为主要的有效成分之一。我们发现，桂枝茯苓胶囊对人宫颈癌Hela细胞增殖有抑制作用\[1\]，中药复方制剂体外细胞实验，给药量少，为了便于说明给药量，我们拟建立以苦杏仁苷作为桂枝茯苓胶囊对体外细胞实验的定量指标。分别用不同浓度乙醇处理桂枝茯苓胶囊，高效液相色谱法测定处理液中苦杏仁苷的浓度。单因素方差分析苦杏仁苷最佳浸出的乙醇浓度。

1 仪器与试剂

ULTIMATE3000高效液相色谱仪 (美国戴安公司)、HYPERSILBDS C18色谱柱(5um，4.6mm ID×150mm 依利特公司)、UV3000紫外检测器。苦杏仁苷对照品（820－9401，中国药品生物制品检定所）、桂枝茯苓胶囊 (江苏康缘药业股份有限公司，国药准字Z10950005批号：081209,091007,100306)、乙腈、甲醇为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 单因素五水平实验设计

以乙醇浓度为考虑的因素，设5个水平：乙醇浓度10％、40%、60%、80%、95%。每个水平做四次实验。以苦杏仁苷浸率为考核指标，考察乙醇的最佳浓度。

2.2 制备

桂枝茯苓胶囊去除胶囊壳，取约0.3g，研钵里混匀碾碎，分别精密称取0.0505g、0.0503g、0.0503g、00501g、0.054g，用10％、40%、60%、80%、95%乙醇2mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33KHz）30min，放冷，再称定重量，用对应浓度乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，续滤液0.2μm滤器过滤, 作为5份样品溶液。

2.3 苦杏仁苷浓度测定

2.3.1 色谱条件

C18色谱柱(4.6mm ID ×150mm,粒径μm);柱温室温;流速mL.min-1。流动相乙腈:0.2%磷酸水(24∶ 76),检测波长为210nm。流速mL.min-1;柱温:室温。最小理论塔板数以苦杏仁苷色谱峰计，应≥1500。在此条件下样品分离度大于2，苦杏仁苷拖尾因子小于1.05。

2.3.2 对照品溶液配制 精密称取1.25mg,加双蒸水溶解稀定容10mL 。即为0.125mg·mL - 1 对照品溶液。

2.3.3 标准曲线制作 分别精密取对照品溶液2.5,5,10,15,20，25（μL）进样,记录苦杏仁苷峰面积。峰面积分别为5.7007、11.741、23.336、35.511、47.636、59.478。以峰面积值为纵坐标（Y）、进样苦杏仁苷绝对量（μg）为横坐标（X），绘制标准曲线Y=19.141X-0.3375。表明苦杏仁苷在0.3125-3.125μg呈线性关系。r=0.9999。

2.3.4 精密度试验 取对照品溶液10μL连续进样5次,测定峰面积分别为:23.346、23.294、23.393、23.336、23213，峰面积平均值为23.317,RSD=0.29%。

2.3.5 重复性实验 精密称取桂枝茯苓胶囊适量,按照供试品制备方法制备6份,取60％乙醇浸提液样品进样10μL。平均浓度为0.166mg·mL -1,RSD为0.28%。

2.3.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，按照上述色谱条件测定6次，在0，1，2，4，8，12h分别进样10μL，测定峰面积。结果RSD为0.37%，表明样品在12h内稳定性良好。

2.3.7 加样回收率试验精密量取已知含量的一个乙醇浸提液样品（取60%的浸提液），精密加入一定量对照品溶液,用流动相补足定容到2mL容量瓶，取15μL进样,测定结果。所得平均加样回收率为99.9%,RSD为0.36%（n=6）。

桂枝茯苓胶囊，按照“2.2”制备供试品溶液，每次取15μL进样，重复3次，记录苦杏仁苷色谱峰面积,利用标准曲线方程计算供试品溶液苦杏仁苷浓度。为了计算方便，记录以HPLC测定的10％、40%、60%、80%、95%乙醇浸出液苦杏仁苷浓度的峰面积分析。见表2、表3。

2.5 结果

10％、40%、60%、80%、95%乙醇浸出液苦杏仁苷分别为0.01999、0.1695、0.1663、0.1613、0.1037mg/mL。且10％、40%、60%、80%、95%乙醇对苦杏仁苷出有显著差异，60%对苦杏仁苷浸出率高。

3 讨 论

在动物实验中，中药固体复方制剂一般给药量以毫克计量，但是在体外细胞实验中，复方制剂都需要特殊的处理后再给药，而且，体外细胞实验给药量小，一般以μL计量。

因此，经过特殊处理的复方制剂，如何说明给药量是我们需要解决的问题。

本实验的目的不是为了精确测定桂枝茯苓胶囊中苦杏仁苷的含量，而是对经过我们不同浓度乙醇处理的处理液中苦杏仁苷进行检测，考察影响桂枝茯苓胶囊中苦杏仁苷浸出的乙醇浓度。便于细胞实验时以苦杏仁苷作为定量依据说明给药计量。

2005版药典用气相色谱测定丹皮酚作为桂枝茯苓胶囊定量指标\[2\]。苦杏仁苷具有良好的抗肿瘤作用,苦杏仁苷对子宫颈癌JJC26株的抑制率为50%～70%\[3\]。对于不同复方制剂中苦杏仁苷的测定，流动相的选择是关键条件之一。如由苦杏仁、苦参等组成的宫颈炎康泡腾片流动相为甲醇∶ 0.2%磷酸 (24∶ 76 ) \[4\]; 由盐酸麻黄碱、苦杏仁等组成麻杏止咳片流动相为水∶ 甲醇∶ 乙腈( 70∶ 25∶ 5 ) \[5\] 等，本实验中，经比较选用流动相乙腈∶ 0.2%磷酸水(24∶ 76)分离效果好。该方法操作简单，精密度高，重现性好。

参考文献

［1］ 黄燕芬，董改霞，柴慧，等.桂枝茯苓胶囊对体外人宫颈癌Hela细胞抑制作用及机理研究\[J\].中华中医药学刊，2010（4）：774－777.

\[2\] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：1部\[S\].北京:化学工业出版社，2005:560．

\[3\] 魏金婷，刘文奇.方药中苦杏仁苷的研究和应用进展\[J\]. 海南医学院学报，2007,13(6)：589－591.

\[4\] 钟文，吴庆杰. HPLC法测定宫颈炎康泡腾片中苦杏仁苷的含量\[J\].广西中医药， 2006,29(1):56－57.

\[5\] 甄攀.麻杏止咳片中苦杏仁苷的HPLC分析\[J\].中成药，2003,25(2):114－115.