结核病的实验室诊断方法

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结核病实验室检查主要有；涂片染色显微镜检查、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定、分枝杆菌基因分型、分枝杆菌血清学及核酸扩增检测等。细菌学检查

细菌学检验结果的准确性首先取决于标本的质量。正确地采集、转送标本，是直接影响检验结果的重要因素和取得准确结果的前提。各种标本(痰液、血液、伤口分泌物和各种感染组织等)采集时应充分考虑到选择恰当合理的时问，考虑到可能存在的病原菌的性质，按要求采集标本，这样可使标本包含细菌，并为后续检验步骤打下良好的基础。合格的痰标本在低倍镜视野里上皮细胞应25个。

涂片染色显微镜检查根据我国结核病防治规划的要求，对咳嗽、咳痰>13周或有咯血或血痰的肺结核可疑症状者，应留取3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰)进行痰涂片抗酸染色检查。即时痰为病人就诊时咳出的痰液：清晨痰为清晨深咳出的痰液；夜间痰为就诊前1天晚睡前咳出的痰液。留取的痰液标本常规涂片后，进行要尔－尼尔逊氏染色法(ziehl-Neelsen)染色。

分枝杆菌分离培养 结核分枝杆菌是兼性需氧菌，最适生长温度为37℃，最适pH为6.5～7.2。分枝杆菌分离培养检查法，是结核病确诊最可靠的方法。是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生物学研究的基础。

当前，我国普遍采用改良L-J(改良罗氏)培养基来分离培养结核分枝杆菌。通常情况下，当每1ml标本中微生物含量达102～3 CFU(菌落形成单位)时，即可培养阳性。分枝杆菌快速培养检查是使用分枝杆菌快速培养仪(MIGT、BacT/A1err、ESP)，通过测定细菌生长代谢检测分枝杆菌生长情况的方法。

在进行分枝杆菌快速培养检查时，标本接种前的祛污染处理，必须严格按照系统说明书中给定的方法进行。孵育检测过程中系统报告阳性时，相应标本的培养液必须首先进行抗酸染色镜检，发现抗酸菌后方可发出阳性报告。

分枝杆菌药物敏感性试验　分枝杆菌药物敏感性试验对于结核病人合理的药物选择、合适的药物剂量以及针对耐药病人的预防控制具有积极的作用。结核病耐药性监测可以为评估制定国家结核病控制规划和控制策略提供科学依据。

分枝杆菌菌种鉴定 目前报道的分枝杆菌种类已有100多种。经抗酸染色镜检确定为抗酸菌的培养阳性菌株，应该先接种改良罗氏(L-J)培养基进行增菌传代后进行传统方法的菌种鉴定。

传统方法进行分枝杆菌菌种鉴定，需要经过硝基苯甲酸(PNB)生长试验、28℃生长试验、耐热触酶试验，观察记录细菌的生长速度、菌落形态和菌落颜色确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群还是NTM。

血清学检测

涂片染色显微镜检查方法有一定的局限性，因为它对处于相对进展状态的结核病诊断具有较强的特异性，但其灵敏度在不同实验室间有所差异。另外，涂片染色显微镜检查需要病人重复送3次痰，这导致有些时候病人的依从性不良，并且涂片染色显微镜检查对涂阴病人、儿童以及肺外结核病不能够给予诊断，在涂片染色显微镜检查过程中，如果操作不当也可能导致实验室人员受到感染。

核酸扩增检测(NAAT)、荧光原位杂交以及荧光高压液相等快速方法，使得诊断结果报告时间缩短至2天。作为因病原微生物感染所导致的结核病，在临床上利用免疫学方法检查宿主对分枝杆菌，特别是结核分枝杆菌感染造成的免疫反应(抗原或／和抗体)，从而帮助临床医师进行鉴别诊断，有一定的实际意义；但由于结核分枝杆菌的生物特性及此类病原菌引起的人体免疫反应较为特殊和复杂，因此，目前结核病免疫学的检测结果，在结核病的临床诊治中，只能够作为辅助参考，不能作为结核病诊断和评价治疗效果的指标。临床医师在参考免疫学检查结果的同时，应该同时参照结核分枝杆菌的传统微生物学检查(包括抗酸染色镜检，特别是分枝杆菌培养检查)的结果并参考其他临床检查手段所得到的结果进行综合判断。

分子生物学检测技术

分子生物学在医学领域取得的飞速发展，研究者也将分子生物学的原理引入了结核病实验研究范围。聚合酶链反应(PCR)是一种以核酸生物化学为基础的分子生物学诊断技术，是生物医学领域内最有价值的研究手段之一。目前对于结核病诊断有较高灵敏度和特异性的方法有：核酸杂交、16S核糖体基因的测序、应用高压液相色谱(HPLC)对细胞壁脂质(分枝菌酸)的分析以及核酸扩增法(hmplicor MTB、MTD Gen-Probe、SDA)。

利用分子生物学方法来研究结核分枝杆菌的生物标志(Biomarker)，从而确定其基因型，可以分析不同类型特征的结核分枝杆菌在人群中的流行变异趋势和分布情况．在一定条件下也可以追溯和确定传染源，为结核病的分子流行病学研究提供可靠的参考指标。当前广泛使用的基因分型方法有：[S6110-RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、VNTR(数日可变的串联重复序列)、MIRU(分枝杆菌散在重复单位分型)、Spoligotyping(间隔区寡核苷酸分型)、SNPs(单核苷酸多态性分析)以及缺失图谱等方法。