不同生长时期伊拉公兔肌内磷脂脂肪酸动态沉积规律及PLS2分析
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇不同生长时期伊拉公兔肌内磷脂脂肪酸动态沉积规律及PLS2分析范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
（西南大学食品科学学院，重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715）
摘 要：以伊拉公兔的背部最长肌（dorsi muscle，LD）、左后腿肌（left rear leg muscle，LL）和腹部肌肉（abdominal muscles，AM）为实验原料，运用气相色谱测定了不同日龄和部位伊拉公兔肌内磷脂的脂肪酸组成。经对比分析显示：随着日龄的增加，伊拉公兔的LD、LL和AM肌内脂肪含量显著增加（P
关键词：伊拉公兔；肌内磷脂脂肪酸；动态沉积；生长时期；PLS2
Research on dynamic diposition law of intramuscular phospholipid fatty acids of male Hyla rabbits during different growth period and the PLS2 analysis
XUE Shan， HE Zhi-fei， LI Hong-jun*
（Chongqing Special of Food Engineering Technology Research Center， College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China）
Abstract： This study determined the fatty acids composition of intramuscular phospholipids of male Hyla rabbit at different ages and sections by gas chromatographic， using the dorsi muscle （LD）， left rear leg muscle （LL） and abdominal muscles （AM） as the experimental material. By comparison： With age increasing， the intramuscular fat content of LD， LL and AM increased significantly （p
Keywords： Male Hyla rabbit； fatty acids of intramuscular phospholipid； dynamic diposition； growth period；Partial least squares analysis （PLS2）
中图分类号：TS251.1 文献标志码：A
近年来，兔肉及其制品作为一种“三低（低脂肪、低胆固醇、低热量）、三高（高蛋白、高赖氨酸、高消化率）”的营养健康资源，日渐得到了众多消费者的信任与青睐[1-2]。据报道，兔肉中富含长链ω-3和ω-6 多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs），具有健脑益智、美容保健、延年益寿等功效，可缓解动脉硬化，降低冠心病、高血压等疾病的发病率[3-4]。肌内磷脂作为肌内脂肪的重要极性组分，是生命的基础物质之一，也是食品重要的营养和风味前提物质[5]。它能够为人们提供多种PUFA必需脂肪酸，曾被誉为“本世纪最伟大的保健品”，且是美国食品及营养委员会推荐的人体每天应当补充的营养素之一。伊拉兔又称伊拉配套系肉兔，是一种从法国引进的具有高磷脂特性的优质食材[6]，养殖效益高且区域化明显，主要集中在四川、重庆、山东、福建等地[7]。从国内外文献来看，已就单一日龄或部位伊拉兔肌内磷脂的组成进行了初探[6，8-9]。本研究以其动态沉积规律及利用偏最小二乘法（Partial least squares regression，pls2）进行回归分析方面的研究，具有一定的科研价值，以期为伊拉兔的推广和研发提供理论依据和创新基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冷却兔肉：伊拉配套系，同一批次公兔35、45、60、75、90 d各30只，同一日龄兔子要求体质量相当，所有伊拉兔取自西南大学动物科学学院养殖场，屠宰后用装有碎冰的保温箱运回实验室，于18℃保藏待用，使用前原料在4 ℃解冻24 h后，去掉表面可见脂肪和筋膜，分割切块，分取兔肉背最长肌（dorsi muscle，LD）、左后腿肌（left rear leg muscle，LL）和腹肌（left rear leg muscle，AM）作为实验材料。
14%三氟化硼-甲醇溶液 德国 CNW公司；Amberlyst-26阴离子交换树脂 美国Sigma公司；氯仿、甲醇、NaCl、无水Na2SO4、丙酮、苯、石油醚、正己烷，以上溶剂均为分析纯 成都市科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
FA1004A电子天平 上海精天电子仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；RE-52AA真空旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；FSH-2A高速匀浆机 上海梅香仪器有限公司；QP-2010型气相色谱仪 日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 脂肪的提取
参考Folch等[10]的方法，将相同部位的兔肌肉绞碎，混匀。称取10 g肌肉样品，加入140 mL氯仿甲醇溶液（2：1，v/v），45 ℃恒温振荡2 h后过滤，往滤液中加入30 mL饱和NaCl溶液，振荡摇匀，静止分层，下层的氯仿层即为脂肪提取液，用无水Na2SO4干燥后，在45 ℃水浴中用旋转蒸发器浓缩，得到肌内脂肪。
1.3.2 脂肪的分离
肌内中性脂肪和磷脂的分离参考Juaneda等[11]的方法，将提取脂肪用2 mL氯仿溶解后，用硅胶柱（Agilent Aampliq Silica）吸附，然后分别用5倍体积的氯仿和3倍体积的甲醇溶液洗脱，分别得到含中性脂肪和磷脂的溶液，旋蒸挥干后称质量即得中性脂肪含量。磷脂的含量用磷脂系数法进行测量[12]。
1.3.3 脂肪酸组成分析
参考Dias等[13]和AOAC[14]的方法，将各脂肪组分置于15 mL具塞试管中，加入3 mL苯和石油醚的混合溶剂（1：1，v/v），轻轻摇动使之溶解。再加入2 mL 质量分数为14%三氟化硼-甲醇溶液，混匀。在45 ℃水浴中反应30 min。加1 mL正己烷使甲酯溶于其中，最后加适量饱和NaCl溶液使全部有机相甲酯溶液上升至试管上部。澄清后吸取上清液，装入进样小瓶中，即可用于气相色谱分析。
脂肪酸甲酯的测定采用气相色谱仪，使用FID检测器和Rtx-Wax毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 ?m），分流比5：1，进样量1 ?L，载气为氮气，流速为3.0 mL/min，进样口和检测器的温度均为250 ℃。柱箱的升温程序为：起始温度为140 ℃，保持1 min；8 ℃/min升到180 ℃并保持5 min；再以3 ℃/min升到210 ℃不保持；最后以5 ℃/min升到230 ℃并保持10 min。脂肪酸的定性采用与标品的保留时间进行对比，定量采用面积归一化。结果使用X±SD表示，每组重复3次。
1.4 统计分析
不同处理样品间脂肪含量或脂肪酸组成的差异用SPSS13.0软件作方差分析，使用一维方差分析程序（one-way analysis of variance），显著性水平设定为5%。
为了更直观的对比不同日龄、不同肌肉部位伊拉兔肌内磷脂脂肪酸组成的差异，分别以5个日龄、3个部位、多不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid/saturated fatty acid，PUFA/SFA）和饱和脂肪酸+单不饱和脂肪酸（saturated fatty acid+ monounsaturated fatty acid，SFA+MUFA）值为X变量，磷脂各主要脂肪酸的百分比含量为Y变量进行PLS2分析。编号1～21分别代表C12：0、C14：0、C15：0、C16：0、C17：0、C18：0、C20：0、C16：1、C18：1n-7、C18：1n-9、C20：1、C18：2、C18：3、C20：2、C20：3、C20：4、C20：5n-3、C22：5n-3和C22：6n-3。PLS分析采用Unscrambler V 9.7，所有数据在分析前均进行标准化。
2 结果与讨论
2.1 不同日龄、不同部位伊拉公兔肌内脂肪和磷脂含量比较
从表1可得知，随着年龄的增加，伊拉公兔LD、LL和AM部位的脂肪含量均显著增加（P
磷脂是从脂肪中分离出的极性成分。肌内磷脂占肌内脂肪的比例为磷脂的相对含量（表1），而肌内磷脂占肌肉重量的比例为磷脂的绝对含量（图1）。如表1可知，随着日龄的增加，伊拉公兔3个部位肌内磷脂含量显著降低（P
横坐标代表伊拉公兔的不同日龄（d）
纵坐标代表伊拉公兔肌内磷脂的绝对含量（肌肉质量%）
图1 不同日龄、不同部位伊拉兔肌内磷脂绝对含量（肌肉鲜重%）比较
Fig.1 Comparison of intramuscular phospholipids content （muscle weight %） from male Ira rabbit in different ages
2.2 不同日龄、不同部位伊拉兔肌内磷脂脂肪酸组成比较
如表2～4所示，各样品中不饱和脂肪酸UFA（PUFA+MUFA）的含量均较高，尤其是长链PUFA的含量丰富。Wood等[16]认为，在肌肉中，磷脂含有显著高比例的PUFA含量，以发挥其作为构成细胞膜主要成分的功能。PUFAs作为一种独特的生物活性物质，对人体有重要的生理功能，ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸都是合成类二十烷酸化合物的前体，它们在体内的平衡对于稳定细胞膜功能、调控基因表达、维持细胞因子和脂蛋白平衡、抗心血管病、促进生长发育等方面起着重要作用，是目前营养生化研究热点之一[17]。
随着日龄的增长，伊拉公兔3个部位肌内磷脂的SFA和MUFA都呈显著增长趋势（P
肌内磷脂的脂肪酸构成是参与风味形成一系列反应的客观基础[20]，其脂肪酸中富含长链PUFA，如亚麻酸、花生四烯酸以及4个以上不饱和键的长链脂肪酸二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸[16]，肌肉中脂肪酸种类和组成是决定脂肪组织理化性质、影响肉质风味的重要化学成分，也对改善肉食风味提高肉的食用价值具有重要意义[21]。目前，有关不同生长时期伊拉兔肌内磷脂脂肪酸的测定罕有报道。由表2～4可知，伊拉兔肌内肌内磷脂的SFA主要是由棕榈酸（C16：0）和硬脂酸（C18：0）组成，MUFA主要是由油酸（C18：1）组成，PUFA中亚油酸（C18：2）和花生四烯酸（C20：4）的含量较高，并且证实了磷脂中富含长链的n-3和n-6 PUFA[3，4]，也与等测定的伊拉兔的主成份一致[22]。在测定的35～90 d期间，伊拉公兔LD、LL和AM三个部位的脂肪酸C16：0、C18：0、C16：1n-7（棕榈油酸）、C18：1n-9、二十碳二烯酸（C20：2n-6）和γ-亚麻酸（C20：3n-6）均显著上升，而C18：2n-6、C20：4n-6、二十碳五烯酸（C20：5n-3，EPA）、二十二碳五烯酸（C22：5n-3，DPA）和二十二碳六烯酸（C22：6n-3，DHA）均呈下降趋势。其中C18：2n-6是几乎所有饲料中都添加的一种主要成分，它可以通过膳食蓄积于畜禽体内，进而在动物体内形成较其他脂肪酸丰富的含量[16]。在兔肉中，C18：2n-6的含量可高达（22±4.7）%[15]，与本研究结果接近。
比较各个部位的脂肪酸变化差异，C16：0在伊拉公兔LD的沉积速度最快，在AM的比例相对较低且沉积速度最慢；公兔LL肌内磷脂C18：0的比例显著高于LD和AM；公兔LD的C18：1n-9的比例高于腹部和腿部，且较之其他部位其随日龄增长的最快；C18：2n-6的比例在公兔LL中的相对含量最高，且含量下降的幅度最大。据报道，在几乎所有肌肉中，C18：2n-6在磷脂中的含量要显著高于中性脂肪的含量，这就意味着瘦肉含量高的胴体中，C18：2n-6这种PUFA的含量更高。同时，随着动物的育肥生长，反刍动物中的PUFA含量会显著下降，这是因为较之磷脂，中性脂肪中的PUFA水平非常低[16]。在35～90 d期间，公兔背部C20：4n-6的初始含量较其他部位高，但随日龄增加减少最快，而其他主要脂肪酸在所测定部位中未见有显著规律。
在测定的伊拉公兔生长期间，其LD、LL和AM三个部分的n-6/n-3值范围分别为4.02～6.61，4.71～5.72和3.97～6.33。随着人们营养健康意识的增强，消费者日益认识到多不饱和脂肪酸对健康的诸多好处，尤其是n-3脂肪酸，因为这些n-3脂肪酸多是人体所必需的[23-25]。研究显示，肉品的营养价值主要是由SFA和PUFA及其n-6和n-3系列脂肪酸之间的比率平衡来确定的。但不幸的是，在西方的饮食中相对于n-3系列脂肪酸，n-6系列的脂肪酸含量偏高[3，26]。据营养学家推荐，PUFA中较好的n-6/n-3比值应该低于5 [27-28]，且当膳食中n-6/n-3比值低于4.0时，能够有效的治疗诸多如冠状动脉心脏疾病和癌症等“生活疾病”[29-30]。根据FAO/WHO的报道，日常健康膳食中必需PUFA n-6/n-3比例推荐剂量为核实5：1～10：1，并且较低比例的n-6/n-3值更能有效的降低一些慢性疾病的风险，但针对不同疾病对n-6/n-3的比例有不同的要求[31]。
2.3 不同日龄、不同部位伊拉兔肌内磷脂脂肪酸组成PLS2分析
PC 1 （Y-explained variance 69%）
X轴代表日龄（35、45、60、75、90 d），部位（LD、LL、AM）8个0/1样品变量、SFA/PUFA和SFA+MUFA值，Y轴代表脂肪酸组成，内圆和外圆分别代表相关系数r2=0.5 （50%） 和 1.0 （100%）。
图2 PLS2分析的前二维主成份效果图
Fig. 2 The PLS2 correlation loadings plot for first two Principal Components （PCs）
横轴PC0～10代表PLS2分析中分别被降维的10个自变量。
图3 伊拉兔肌内磷脂脂肪酸PLS2残差分析
Fig. 3 PLS2 residual analysis of intramuscular phospholipid fatty acids of Ira rabbit
如图2所示，第1和2主成份分别解释了Y变量的69%和16%，相当一部分Y变量位于r2=50%和100%之间，且残差检验值下降快、数值小，说明分析效果基本良好（图3）。营养学上一般用PUFA/SFA值来评价肉的营养价值，此值越高代表营养价值越好；另外，Cameron等[32]认为若肉中SFA+MUFA的含量越高，则肉的嫩度、性和风味都较好，相反如果PUFA含量过高则嫩度、风味和都较差，因此可以用SFA+MUFA值来衡量样品在加工后的风味等质量指标。
从图2可看出，伊拉公兔肌内总脂肪酸与磷脂的PUFA/SFA值均位于效果图的最右方，说明越靠右的样品营养价值越高，而二者SFA+MUFA值均位于效果图的最左方，因此越接近左边的样品加工后风味越好。在第1主成份上，不同日龄的原料脂肪酸组成差异较大，其中日龄35、45 d和60 d在效果图的偏右边，主要与一些多不饱和脂肪酸联系紧密，而75 d和90 d在效果图的偏右边，主要与大部分的饱和及单不饱和脂肪酸联系较紧密，说明75～90 d日龄的伊拉兔肉加工后风味较好但营养价值相对较低，相反35～60 d日龄的伊拉兔营养价值较高但加工后风味较差；在第2主成份上，不同部位的原料脂肪酸组成差异较大，而公兔AM和LD均位于效果图的下半部分，而左后腿位于效果图的上半部分。其中，LD和AM脂肪酸随日龄变化与P4（C15：0）联系较为紧密，这也说明C15：0在LD和AM中的含量相对LL较高而LL脂肪酸变化受P9（C18：0）影响更显著。总体来说，不同日龄和部位伊拉公兔的脂肪酸组成差异均明显，且分别区别于第2和第1主成份，在第1主成份上，35～90 d日龄的原料与PUFA/SFA值的距离依次变远，说明随着年龄的增加，伊拉兔肉的营养价值逐渐降低，但加工后产品的风味却越来越好，其中LL更适于加工；在第2主成份上，60d～90 d的公兔原料位于效果图的上半部分，其中35d日龄的兔子与P12（C18：2n-6）、P18（C20：4n-6）、P19（C20：5n-3）、P20（C22：5n-3）和P21（C22：6n-3）紧密相关，即35 d兔肉中这几种长链PUFA含量较为丰富。随着日龄的增长，45 d公兔与P1（C12：0）和P8（C17：1）联系较为密切，60 d与P7联系较为密切，75 d与P3（C14：1），P14（C20：0）和P15（C20：1n-9）较为密切，90 d与P13（C18：3n-3）、P16（C20：2n-6）和P17（C20：3n-6）相对密切，即P13、P16和P17对90d公兔肌内磷脂中PUFA的贡献高于其他日龄的兔子。
3 结 论
与其他畜禽相比，伊拉兔肉是一种低脂肪、低n-6/n-3值、高磷脂、高PUFA含量的优质肉源。随着日龄的增加，伊拉公兔呈现出肌内总脂肪沉积增多（肌肉鲜重%）、磷脂含量（肌内脂肪%）减少的特点，但肌内磷脂在肌肉中的绝对比例未出现显著变化。在35～90 d的生长期间，35 d兔肉的营养价值较好，而90 d兔肉更适宜加工，LD，LL和AM的肌内磷脂脂肪酸组成均存在显著性差异，其中LL肌内磷脂不但相对含量较其他部位高，而且从脂肪酸组成来说营养价值更高。鉴于这种差异性，会对兔肉的加工品质和营养特性造成影响，这也将是需要继续探讨的课题。
参考文献：
[1]薛山， 贺稚非， 李洪军. 兔肉胶原蛋白特性及评定方法研究[J]. 食品工业科技， 2013， 34（4）： 372-377.
[2]薛山， 贺稚非， 李洪军. 伊拉兔宰后肌糖原变化及其与兔肉品质的相关性[J]. 中国农业科学， 2014， 47（4）： 814-822.
[3]ENSE M， RICHARDSON R I， WOOD J D， et al. Feeding linseed to increase the n 3 PUFA of pork： fatty acid composition of muscle， adipose tissue， liver and sausages[J]. Meat Science， 2000， 55， 201-212.
[4]COOPER S L， SINCLAIR L A， WILKINSON R G， et al. Manipulation of the n-3 polyunsaturated acid content of muscle and adipose tissue in lambs[J]. Journal of Animal Science， 2004， 82： 1461-1470.
[5]王道营. 南京板鸭肌内磷脂的分析检测及其在加工过程中的变化规律研究[D]. 南京： 南京农业大学， 2006.
[6]， 贺稚非， 陈红霞， 等. 不同畜禽肌肉脂肪酸组成的对比分析[J]. 食品工业科技， 2013， 34（18）： 123-126.
[7]谢晓红， 郭志强， 秦应和. 我国肉兔产业现状及发展趋势[J]. 中国畜牧杂志， 2011（4）： 34-38.
[8]， 贺稚非， 陈红霞， 等. 伊拉兔肉肌内脂肪酸组成及温度对其脂肪氧化的研究[J]. 食品工业科技， 2013， 34（20）： 140-143.
[9]， 贺稚非， 陈红霞， 等. 伊拉兔肉脂肪酸组成的GC-MS分析[J]. 食品科学， 2013， 34（24）： 154-157.
[10]FOLCH L M， SLOANE G H S. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues[J]. Journal of Biological Chemistry， 1957， 226（1）： 497-509.
[11]JUANEDA P， ROCQUELIN G. Rapid and convenient separation of phospholipids and non phosphorus lipids from rat heart using silica cartridges[J]. Lipid， 1985， 20： 40-41.
[12]BARTLETT G R. Phosphorus assay in column chromatography[J]. Journal of Biological Chemistry， 1959， 234（3）： 466-468.
[13]DIAS I， YAAKOB B C， SHUHAIMI M， et al. Lard detection based on fatty acids profile using comprehensive gas chromatography hyphenated with time-of-flight mass spectrometry[J]. Food Chemistry， 2010， 122： 1273-1277.
[14]AOAC. Official Method 996.06 Fat （Total， Saturated， and Unsaturated ） in Foods Hydrolytic Extraction Gas Chromatographic Method[S]. US： AOAC International， 2001.
[15]HERN?NDEZ P， DALLE ZOTTE A. Influence of diet on rabbit meat quality[M]. Nutrition of the rabbit. Madrid： J. Wiseman，2010： 163-178.
[16]WOOD J D， ENSER M， FISHER G R， et al. Fat deposition， fatty acid composition and meat quality： a review[J]. Meat Science， 2008， 78（4）： 343-358.
[17]孙翔宇， 高贵田， 段爱莉， 等. 多不饱和脂肪酸的研究进展[J]. 食品工业科技， 2012， 33（7）： 418-423.
[18]SALMA U， MIAH A G， MAKI T， et al. Effect of dietary Rhodobacter capsulatus on cholesterol concentration and fatty acid composition in broiler meat[J]. Poultry Science， 2007 86： 1920-1926.
[19]KANATT S R， CHANDER R， SHARMA A. Effect of radiation processing of lamb meat on its lipids[J]. Food Chemistry， 2006， 97： 80-86.
[20]GRAY J I， GOMAA E A， BUCKLEY D J. Oxidative quality and shelf life of meats[J]. Meat Science， 1996， 43： S111-S123.
[21]万红玲， 雒林通， 吴建平. 牦牛肉品质特性研究进展[J].畜牧兽医杂志， 2012， 31（1）： 36-40.
[22]， 贺稚非， 陈红霞， 等. 不同部位伊拉兔肉脂肪酸组成的对比分析[J]. 食品科学， 2013， 34（24）： 154-157.
[23]ALESSANDRI J M， GOUSTARD B， GUESNET P， et al. Docosahexaenoic acid concentrations in retinal phospholipids of piglets fed an infant formula enriched with long-chain polyunsaturated fatty acids： effects of egg phospholipids and fish oils with different ratios of eicosapentaenoic acid to docosahexaenoic acid[J]. The American Journal of Clinical Nutrition， 1998， 67： 377-385.
[24]CONQUER J A， HOLUB B J. Effect of supplementation with different doses of DHA on the levels of circulating DHA as non-esterified fatty acid in subjects of Asian Indian background[J]. Journal of Lipid Research， 1998， 39： 286-292.
[25]SIMOPOULOS A P. N-3 fatty acids and human health： defining strategies for public policy[J]. Lipids， 2001， 36： S83-S89.
[26]HARGIS P S， VAN ELSWYK M E. Manipulating the fatty acid composition of poultry meat and eggs for the health conscious consumer[J]. World's Poultry Science Journal， 1993， 49： 251-264.
[27]KOUBA M， ENSER M， WHITTINGTON F M， et al. Effect of a high linolenic acid diet on lipogenic enzyme activities， fatty acid composition， and meat quality in the growing pig[J]. Journal of Animal Science， 2003， 81： 1967-1979.
[28]WOOD J D， RICHARDSON R I， NUTE G R， et al. Effects of fatty acids on meat quality： a review[J]. Meat Science， 2003， 66： 21-32.
[29]SIMOPOULOS A P. Omega-3 fatty acids and antioxidants in edible wild plants[J]. Biological Research， 2004， 37（2）： 263-277.
[30]WILLIAMS C M. Dietary fatty acids and human health[J]. Annales de Zootechnie， 2000， 49： 165-180.
[31]SIMOPOULOS A P. The importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids[J]. Biomedical Pharmacotherapy， 2002， 56： 365-379.
[32]CAMERONA N D， ENSER M B. Fatty acid composition of lipid in Longissimus dorsi muscle of Duroc and British Landrace pigs and its relationship with eating quality[J]. Meat Science， 1991， 29（4）： 295-307.