四物汤及其配伍对大鼠肝脏P450酶活性及mRNA表达的影响
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[摘要] 研究四物汤复方及其配伍对大鼠肝脏p450酶活性及其mrna表达水平的影响。大鼠口服灌胃四物汤及其配伍水煎液2周后，处死，用生理盐水灌流肝脏，制备肝微粒体，采用混合探针与肝微粒体体外孵育法考察四物汤对大鼠肝脏细胞色素P450酶的影响。利用实时定量聚合酶链式反应（Q-PCR）检测四物汤对大鼠肝脏细胞色素P450 mRNA表达的影响。四物汤复方组CYP1A2酶活性与对照组相比升高（P
[关键词] 四物汤；肝微粒体；细胞色素P450酶
[收稿日期] 2013-04-27
[基金项目] 国家自然科学基金重点项目（81130067）；国家自然科学基金面上项目（81073028， 81274127）
[通信作者] *高月，Tel：（010）66931312，E-mail： gaoyue@bmi、ac、cn；*马增春，Tel：（010）66932201，E-mail： 13681121635 @139、com
[作者简介] 梁淼，硕士研究生，Tel：（010）66930267， E-mail： liangmiao_0423@126、com 细胞色素P450酶（cytochrome P450），是重要的药物Ⅰ相代谢酶，可以催化药物进行氧化、还原、水解等反应，在内源性和外源性物质的代谢中起着极其重要的作用[1]。同时CYP450酶的活性能被多种化合物诱导或抑制，改变其他药物的代谢清除率，使药物的代谢加快或减慢，从而引起药物间的相互作用[2]。人体内约有75%的药物是经由P450酶代谢的，因此CYP450酶系统在药物的相互作用方面发挥着重要作用。参与体内大多数药物代谢的P450酶亚型主要有CYP1A2，CYP2B6，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP3A4，CYP2E1，临床药物的95%经由这些亚型代谢[3]。根据实验室已经建立的混合探针的测定方法，选择了大鼠体内相对应的6种亚型CYP1A2，CYP2B1，CYP2C12，CYP2C13，CYP2D2，CYP3A1[4]进行研究。
中医用药以复方为主，中药成分虽然复杂，但进入人体内都要经过CYP450酶进行代谢转化，对细胞色素P450酶活性产生影响，不同中药的众多成分间形成了复杂的相互作用体系。研究中药有效成分对CYP450酶系统的影响规律有助于阐明中药及其有效成分间的相互作用和中药药理作用机制，为揭示传统中药配伍理论科学内涵和临床合理配伍用药提供依据[5]。目前，研究中药复方及不同配伍对CYP450酶活性差异多采用探针药物法，Cocktail探针药物法是指同时给予多种相对低剂量的探针药物，测定生物样本中的每个探针药物的代谢率或其他分型指标，以获取多个代谢酶的表型信息[6]。
四物汤来源于宋代《太平惠民和剂局方》，由熟地、当归、白芍、川芎4味药组成[7]，在临床上主要用于补血、活血、调经，是治疗血虚证的常用药，也是经典的按“君、臣、佐、使”原则组成的复方[8]。本研究采用Cocktail探针药物法研究四物汤复方及其各味单药和2味药配伍对大鼠肝微粒体6种CYP450亚型（CYP1A2，CYP2B1，CYP2C12，CYP2C13，CYP2D2，CYP3A1）的影响，并利用Q-PCR检测四物汤复方及4味单药对大鼠肝脏4种P450同工酶CYP1A2，CYP2B1，CYP2C11，CYP3A1 mRNA表达的影响，以期为临床合理联合用药提供参考，并从药物代谢酶角度去研究四物汤君臣佐使的配伍规律。
1 材料
1、1 药品与试剂 四物汤由熟地、当归、白芍、川芎组成，全部药物均购自安徽亳州同仁堂中药厂。咪达唑仑（midazolam）、甲苯磺丁脲（tolbutamide）、非那西丁（phenacetin）、右美沙芬（dextromethorphan）、扑热息痛（paracetamol）、普萘洛尔（propranolol）均购自中国食品药品检定研究院。S-美芬妥因（S-mephenytoin），1′-羟基咪达唑仑（1′-OH midazolam），4-羟基甲苯磺丁脲（4-OH tobutamide），4-羟基美芬妥因（4-OH mephenytoin），右啡烷（dextrorphan），安非他酮（Bupropion），4-羟基安非他酮（4-OH bupropion）均购自美国BD公司。还原型辅酶Ⅱ购自Roche公司。RNA提取试剂盒（Biomed公司），逆转录酶及Q-PCR扩增试剂购自TransGen公司。CYP1A2，CYP2C11，CYP2B1，CYP3A1及内参β-actin的引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。甲醇和乙腈为色谱纯，购自Fisher（美国），实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
1、2 动物和分组 Wistar大鼠，180～220 g，雄性。由军事医学科学院实验动物中心提供。实验动物生产许可证号SYXK（军）2007-004，实验动物合格证号SCXK（军）2007-004。动物随机分为对照组、四物汤组、熟地组、当归组、白芍组、川芎组、熟地+当归组、熟地+白芍组、熟地+川芎组、当归+白芍组、当归+川芎组、白芍+川芎组。每组8只，复方组给药剂量为5 g・kg-1・d-1，其他各组给药剂量按其在复方中所占比例等量换算（熟地-当归-白芍-川芎15∶10∶10∶6）。空白组给予等量生理盐水，连续灌胃14 d后，处死动物制备肝微粒体并提取动物肝脏总RNA。
1、3 仪器 Agilent 1290型超高效液相色谱仪（UHPLC，美国Agilent公司）；Agilent 6410B型三重四极杆串联质谱仪（美国Agilent公司）；Agilent ZORBAX EclipsePlus-C18色谱柱（2、1 mm×100 mm，3、5 μm，美国Agilent 公司）；RE52CS型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；电热恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；BS 223S型电子天平[塞多利斯科学仪器（北京）有限公司]；ABI Step One Plus荧光定量PCR仪。
2 方法
2、1 供试样品的制备 四物汤水煎液按《太平惠民和剂局方》规定的剂量称取组成，熟地15 g，当归10 g，白芍10 g，川芎6 g，共计41 g・d-1。按《中药药理研究方法学》计算大鼠的等效剂量为5 g・kg-1・d-1。经水煎、过滤、浓缩、配制成100%药液（即每1 mL药液含生药1 g），各单味及两两配伍各组药按同样的方法均配制成相当于四物汤（1 g・mL-1）的浓度，即每种药液浓度均与其在复方中浓度一致（按生药量计熟地0、366 g・mL-1，当归0、244 g・mL-1，白芍0、244 g・mL-1，川芎0、146 g・mL-1）。置于4 ℃保存备用。
2、2 肝微粒体的制备 大鼠脱臼处死，迅速剪开心脏，用注射器以4 ℃生理盐水由门静脉灌洗，结扎上腔静脉，灌洗至肝脏呈土黄色。采用差速离心法制备，将肝脏剪碎，按1∶4加入TMS缓冲液，冰浴中匀浆。匀浆液4 ℃，12 000×g离心20 min，弃沉淀。上清液4 ℃，105 000×g离心60 min，弃上清，沉淀部分即微粒体。按初始匀浆时每克肝组织加入1 mL Tris-HCl储存液（4 ℃），重悬微粒体，冰浴，玻璃匀浆管手动研磨，使微粒体均匀分散。分装微粒体。-80 ℃保存。采用BCA法测定肝微粒体蛋白浓度。
2、3 总RNA提取及鉴定 大鼠处死后迅速取出肝脏，置于液氮中保存。按RNA提取试剂盒说明书提取肝脏总RNA。紫外分光光度计法测定RNA浓度，A260/A280在1、7～1、9，电泳分析表明18S和28S条带清晰可见，总RN段完整未降解可用。
2、4 逆转录及实时定量聚合酶链式反应（Q-PCR） 取总RNA 1 μg，分别加入2×TS Reaction Mix 10 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，Anchored Oligo（dT）18 1 μL，加RNase-free Water至终体积为20 μL并混合均匀。反转录的条件为42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，进行扩增反应并在-20 ℃保存待用。逆转录产物2 μL，加入2×TransStart Green qPCR SuperMix 10 μL，Forward Primer 0、4 μL，Reverse Primer 0、4 μL，Passive Reference Dye 0、4 μL，加ddH2O 补足反应体系至20 μL，荧光实时定量PCR的条件为94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。以β-actin作为内参基因，进行PCR扩增的实时定量分析。mRNA表达水平采用比较阈值法进行定量分析，所扩增的目的基因诱导或抑制的倍数= 2-ΔΔCt，即RQ值。ΔΔCt=实验组ΔCt（目的基因Ct-内参基因Ct）-对照组ΔCt（目的基因Ct-内参基因Ct），Ct值为测定的达到荧光阈值的循环数[9]。实验重复测定3次。特异性引物序列见表1。
2、5 液质联用检测条件 液相条件：以流动相A（含0、1%甲酸和5 mmol・L-1甲酸铵的纯水）和B（含0、1%甲酸的乙腈）梯度洗脱，30%B（0 min），95%B（1、5～3、5 min），30%B（3、6 min）；柱温25 ℃，流速0、45 mL・min-1，运行时间4、5 min，进样体积10 μL。内标为普奈洛尔（100 μg・L-1）。
质谱条件：以ESI源正离子MRM方式检测，毛细管温度320 ℃，毛细管电压+4 000V，雾化电压172.375 kPa，干燥气流速10 L・min-1，其他质谱分析参数见表2。
2、6 肝微粒体孵育体系 孵育体系包括肝微粒体（0、5 g・L-1），NADPH（1 mmol・L-1），CYP特异性探针底物非那西丁（10 μmol・L-1）、甲苯磺丁脲（25 μmol・L-1）、安非他酮（25 μmol・L-1）、美芬妥因（50 μmol・L-1）、右美沙芬（5 μmol・L-1）和咪达唑仑（2、5 μmol・L-1），K2HPO4/KH2PO4缓冲液（0、05 mol・L-1，pH 7、4）补足体系至200 μL。37 ℃水浴预孵育5 min后加入同样预孵育5 min的NADPH启动反应，37 ℃水浴孵育30 min，加入200 μL的甲醇-乙腈（1∶1）含有内标盐酸普奈洛尔100 μg・L-1的溶液终止反应，4 ℃13 000×g离心10 min，取上清液进样定量分析各底物的代谢产物生成率，测得酶活性。
2、7 数据分析 实验数据以±s表示，对照组和各给药组之间差异的比较用t检验，P
3 结果
3、1 四物汤对大鼠肝脏6种亚酶活性的影响 本实验用Cocktail混合探针药物法同时测定了四物汤复方以及各个单药和两两配伍各组对大鼠肝脏6种亚酶活性的影响，见表3，四物汤复方组与对照组相比对CYP1A2酶活性具有明显的诱导作用（P
3、2 四物汤单药对大鼠肝脏P450酶mRNA表达的影响 本实验用实时定量PCR考察了四物汤复方和4味单药对大鼠肝脏4种P450同工酶mRNA表达的影响，见图1，复方组对CYP1A2 mRNA的表达具有上调作用（P
4 讨论
药物间相互作用可发生在吸收、分布、代谢和排泄4个阶段，代谢性相互作用的发生率最高，大约占药物相互作用的40%。在外源性化合物（包括药物和毒物）的生物转化中CYP450酶系起着非常重要的作用，其活性决定着药物的代谢速率，是造成代谢性药物相互作用的重要原因[10]。药物间的相互作用约70%是由酶的抑制作用引起的，其中酶抑制作用导致药物相互作用的临床意义远大于酶诱导作用[11]。体外孵育实验结果表明四物汤复方对大鼠肝脏CYP2B1的酶活性具有抑制作用，对CYP1A2
图1 四物汤复方以及4味单药对大鼠肝脏P450酶mRNA表达影响
Fig、1 Effects of Siwu Tang and its four componts drugs on enzyme activity in rat liver
的酶活性具有诱导作用，对CYP2C12，CYP2C13，CYP2D2，CYP3A1 4种亚酶活性无显著性影响。CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP3A4 4种亚酶在肝脏中所占比例较大，参与了临床90%以上药物的代谢，因此四物汤在临床上与绝大多数的药物合用时是安全的。CYP2B6参与了大约7%的常用药物的代谢，有化疗类药物环磷酰胺，抗雌激素类药物它莫西芬，抗惊厥类药物S-美芬妥英，苯二氮类地西泮等[12]。四物汤在与这些药物合用时要注意减低使用剂量。CYP1A2 参与临床4%药物的代谢，主要有咖啡因、非那西丁、茶碱、氯氮平、丙米嗪、他克林、多环芳烃类致癌物以及咪唑喹啉派生物等20多种药物[13]。四物汤可以诱导CYP1A2的酶活性，加快药物的代谢导致药效降低，因此联合用药时要注意剂量的使用。
本实验还考察了四物汤以及4味单药对大鼠细胞色素P450同工酶mRNA表达水平的影响。实验结果表明，复方对CYP1A2的mRNA表达具有上调作用，与酶活性水平相平行。熟地组和川芎组对CYP1A2的mRNA表达上具有下调作用，与熟地和川芎对酶活性的调节趋势具有一致性。复方以及4味单药对CYP2B1的mRNA表达均具有下调趋势，且4味单药的下调作用与对照组相比具有显著性差异，与对酶活性水平的调节相平行。四物汤对CYP1A2和CYP2B1酶活性的调节可能是通过调节细胞色素P450s mRNA的表达使相应的酶活性发生变化[14]。
本研究在此基础上考察了四物汤中的4味单药两两配伍对酶活性的影响，以期从药物代谢酶角度探讨四物汤成分间的配伍规律。熟地和白芍，当归和白芍，当归和川芎，白芍和川芎配伍后对CYP1A2的酶活性具有抑制作用，熟地和当归作为君臣2味主药对CYP1A2的酶活性具有上调趋势，但与白芍作用后均显著下调了CYP1A2的酶活性，说明在对CYP1A2酶活性的调节上白芍体现出一定反佐的作用。但四物汤复方对CYP1A2的酶活性则具有诱导作用，可见四物汤复方整体对CYP1A2酶活性的调节作用大于熟地和当归的作用。四物汤4味单药对CYP2C13酶活性并无显著影响，但熟地和白芍，当归和白芍，川芎和白芍，当归和川芎配伍之后都不同程度的抑制了CYP2C13的酶活性，复方对CYP2C13酶活性虽有下调趋势但并无显著性差异，因此四物汤整体相互作用后抵消了两两配伍的下调作用。
中药复方产生药效的基础主要是基于复方整体之间的相互作用，从四物汤单药及两两配伍药对对酶活性的调控可以看出，复方对酶活性的影响并不是其单药效应的简单加合，此外，体外实验不能全面 的反应体内实验和临床实验的结果。因此研究中药药理作用的分子机制，中药间及中西药间相互作用的机制、解释中药配伍理论的科学内涵还要进行更加深入的研究。
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Effect of Siwu decoction and its combined administration on hepatic
P450 enzymatic activity and mRNA expression in rats
LIANG Miao1， 2， MA Zeng-chun2*， YI Jian-feng2， WANG Yu-guang2， TAN Hong-ling2，
XIAO Cheng-rong2， LIANG Qian-de2， TANG Xiang-lin2， LI Hua3， SHEN Guo-lin3， GAO Yue2*
（1、 School of Pharmacy， Guangxi Medical University， Nanning 530021， China；
2、 Research Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Science， Beijing 100850， China；
3、 Research Institute of Toxicology and Pharmacology， Academy of Military Medical Science， Beijing 100850， China）
[Abstract] To study the effect of Siwu decoction （SWD） compound and its combined administration on hepatic P450 enzymatic activity and mRNA expression in rats、 Rats were orally administered with SWD and water decoction combined with other medicines for two weeks， and then sacrificed、 Their livers were perfused with normal saline to prepare liver micrisomes、 Mixed probe and liver microsome in vitro incubation method were adopted to detect the effect of SWD on hepatic cytochrome P450、 The real-time quantitative polymerase chain reaction （Q-PCR） was used to detect the effect of SWD on the expression of hepatic cytochrome P450、 Compared with the control group， the SWD compound group showed higher CYP1A2 enzymatic activity （P
[Key words] Siwu decoction； liver microsome； cytochrome CYP450 enzyme
doi：10.4268/cjcmm20132123