不同模式低氧对大鼠认知功能及JNK表达的影响

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阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS）是在睡眠状态下，由于上气道软组织肌肉的反复塌陷等原因引起的呼吸暂停和低通气，患者睡眠中血氧饱和度变化幅度大，低氧及高碳酸血症明显，机体发生一系列病理生理变化，严重危害人类健康。研究显示，学习记忆功能下降是OSAHS患者神经系统受损的主要表现之一［1］，而海马参与学习记忆过程，海马CA1区对缺血、缺氧最敏感，海马结构的完整性对于空间学习至关重要。国内外研究发现磷酸化jnk蛋白（P-JNK）可对大鼠海马长时程增强起抑制作用［2］，从而导致记忆功能障碍。本研究通过模拟OSAHS患者的病理生理特点，建立不同时间点的低氧模型；同时与持续低氧相比较，动态观察大鼠的学习记忆功能与海马超微结构及P-JNK蛋白的表达，探讨它们之间的关系。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Morris水迷宫视频跟踪分析系统（中国医学科学研究院药物研究所）；H-7500透射电镜（日本日立公司）；低氧动物舱（天津医科大学研制）；空气净化器（型号：FS-10，浙江温岭市泽国空压机有限公司）；LeikaUC6型超薄切片机（德国Leika公司）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；JNK兔源多克隆抗体（#9252）、 P-JNK 鼠源单克隆抗体（#9255）（美国Cell Signaling公司）。

1.2 动物、分组及模型制作

雄性Wistar大鼠144只，体质量（170±10） g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。许可证编号：SCXK（京）2006-0009。将大鼠随机（随机数字法）均分为3组：空白对照组（UC组）、10%慢性间歇性低氧组（10%CIH组）、10%持续低氧组（10%CH组）。各组又分为2、4、6、8周时相组，各时相组12只大鼠。每天9∶00—17∶00时，将大鼠置于模型仓内，10%CIH组循环交替给予不同流量氮气和压缩空气，使箱内前30 s氧体积分数逐渐降至10%，接着40 s氧体积分数逐渐恢复至21％，并维持50 s。持续向10%CH组低氧舱内充入相同流速氮气和压缩空气，舱内氧体积分数维持在10%。整个过程用数字测氧仪监测，保持各组舱内氧体积分数波动范围在±0.5%以内；UC组大鼠放入舱内给予压缩空气。实验结束将实验动物取出，送入常规饲养箱内自由饮水与摄食，生活环境及饲养条件相同。

1.3 Morris水迷宫测试大鼠学习记忆功能

利用Morris水迷宫进行检测。每只动物晨起进行逃避潜伏及穿越平台训练5次后分别在上、下午各测试6次，记录各组大鼠逃避潜伏期时间及穿越平台位置的次数，取检测记录的平均值。

1.4 电镜观察低氧后海马区形态学变化

实验组及对照组大鼠分别于2、4、6、8周时随即抽取3只大鼠麻醉灌注固定断头取脑，冰台上取大脑冠状缝左右0.2 cm组织，切成1 mm3组织块，固定、冲洗、漂洗、脱水、浸透、包埋后超薄切片，透射电子显微镜下观察脑组织超微结构变化。

1.5 海马CA1区P-JNK蛋白表达的测定

将已完成的大鼠脑组织病理切片，采用SABC 免疫组化染色法检测，观察阳性细胞，采用Motic医学图像分析系统免疫组化分析模块计算相同面积阳性目标的积分光密度值（IOD值）。Western blot 法检测大鼠海马组织P-JNK蛋白含量。

1.6 统计学方法

应用SPSS 13.0统计分析软件对数据进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组比较用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，以P

2 结果

2.1 Morris水迷宫实验结果

与UC组比较，实验组大鼠在第4、6、8周逃避潜伏期时间延长、跨越目标象限时间缩短；且第6周时变化明显。与10%CH组比较， 10%CIH组大鼠第6、8周避潜伏期时间明显延长、跨越目标象限时间显著缩短，差异具有统计学意义（P

2.2 间歇性低氧后海马区电镜形态学变化

UC组大鼠海马神经元细胞核规则，核仁清晰，核质均匀散在，核膜光滑，边缘清晰，神经元内细胞器，包括高尔基体、粗面内质网、多聚核糖体、线粒体、溶酶体等丰富，结构正常；突触结构完整清晰。第2周10%CH组和10%CIH组神经细胞超微结构变化不明显，细胞器数量丰富，结构较完整。第4周10%CH组和10%CIH组可观察到神经细胞水肿等变化；第6周10%CH组可观察到神经细胞水肿明显，细胞核松散、细胞膜结构欠规整等变化；10%CIH组可见部分核仁消失，胞浆中的电子密度减低区增多，糖原颗粒、线粒体数量减少。第8周10%CH组可观察到神经细胞水肿明显，细胞核松散、细胞膜结构欠规整；10%CIH组可见部分核仁消失，糖原颗粒、线粒体数量减少。见图1。

2.3 各组大鼠海马组织P-JNK蛋白检测结果

2.3.1 免疫组化结果 光学显微镜下各组大鼠海马区神经元均可见阳性细胞，阳性表达细胞为细胞核呈棕黄色或浅黄色，少部分细胞浆着色，UC组大鼠海马区神经元可见少量阳性细胞表达，间歇低氧组海马区可见较多阳性细胞表达，其中以海马CAl区表达最多。与UC组比较，10%CIH、10%CH组大鼠在第2、4、6、8周海马CAl区P-JNK蛋白表达均增多，差异具有统计学意义（P

2.3.2 Western blot结果 与UC组比较，10%CIH、10%CH组大鼠在第2、4、6、8周海马区P-JNK蛋白表达均增多，差异具有统计学意义（P

3 讨论

OSAHS是一种发病率较高的慢性睡眠呼吸疾病，国外资料显示OSAHS在成年人中的发病率为2%～4%，是多种全身疾病的危险因素［3］。由于OSAHS患者夜间反复发作的呼吸暂停需持续较长时间才可能导致各系统并发症，故在人类进行OSAHS发病机制的前瞻性研究，尤其是直接对患者进行实验性研究存在诸多困难，因此相关的动物研究值得进行。本研究采用的慢性间歇性缺氧模型在分析原有造模方式［4-5］的基础上，利用实时氧监测的反馈信号，实现了浓度结合时间切换的方式，即当O2体积分数达到最低时，维持一定时间（10 s）再行切换，更加接近临床呼吸暂停事件的真实状态，实现了间歇低氧30次/h目标，模拟了人类OSAHS的状态，为研究OSAHS心脑血管等靶器官损害提供了更加标准的装置。

在动物空间记忆研究中最常使用的是Morris水迷宫和八臂迷宫， Morris水迷宫作为一种检测手段对大鼠海马损伤后效应特别敏感。本实验对大鼠进行了间歇低氧和持续低氧及4个不同时间点的学习记忆功能的比较。结果表明，低氧组较正常组比较，寻找平台的时间延长，跨越目标象限时间缩短，且10%CIH组最明显，且低氧6周与8周差异不显著。说明轻度间歇性低氧大鼠的损害需要持续进行一定时间后方出现明显的学习记忆功能障碍，且较持续性低氧更为严重。本实验结果表明，低氧可对大鼠的学习记忆能力造成一定的损伤，且10%CIH较10%CH对大鼠的记忆损伤严重，随着低氧时间的延长，记忆功能损伤加重。本研究结果与Kheirandish等［6］的类似。而谭胜玉［7］研究认为间歇低氧（8％～10%）5周后大鼠表现出明显的记忆功能障碍，分析其原因：（1）可能与CIH动物模型建立方法上的差异有关；（2）可能与大鼠和小鼠对慢性间歇低氧反应性的不同有关。

JNK是哺乳动物细胞中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路之一，JNK信号通路参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架构建、细胞凋亡等多种生物学反应［8］，功能失调可造成缺血-再灌注损伤、慢性炎症、神经退行性变、糖尿病和肿瘤等多种疾病。研究表明，JNK／p38在缺血性神经元凋亡中发挥着重要作用。JNK在其上游激酶的催化下发生磷酸化修饰而被激活，活化的JNK（P-JNK）与ATF-2及C-Jun等转录因子结合，使转录因子的活性区域发生磷酸化，启动一系列信号途径而促进细胞凋亡［9］。亦有研究表明，慢性间歇缺氧可导致海马CAl区氧化应激状态，从而激活JNK信号转导，介导海马神经元凋亡［10］。本实验结果表明，随低氧时间延长，CIH组大鼠海马组织P-JNK蛋白表达量增加，呈时间依赖性，但第6周与第8周比较，差异无统计学意义，说明随低氧时间的延长，机体对低氧有一定的耐受能力，不排除低氧后期机体激活了保护机制。

OSAHS引起记忆功能损害的病理生理机制是复杂的，夜间低氧血症是导致OSAHS的记忆功能损害的重要机制，低氧血症的类型与记忆功能损害程度密切相关。

参考文献

［1］Row BW．Intermittent hypoxia and cognitive function：implications from chronic animal models［J］．Adv Exp Med Biol，2007，618：51-67．

［2］Barry CE， Nolan Y， Clarke RM， et al. Activation of c-Jun-N-terminal kinase is critical in mediating lipopolysaccharide-induced changes in the rat hippocampus ［J］. J Neurochem，2005， 93（1）：221-31.

［3］Li RC，Row BW，Kheirandish L，et al.Nitric oxide synthase and intermittent hypoxia-induced spatial learning defcits in the rat［J］.NeurobioDis ，2004，17（1）：44-53

［4］李庆云，李敏，冯耘，等.新型动物慢性间歇低氧箱的制作和应用［J］.上海交通大学学报：医学版，2008，28（9）：1078-1080.

［5］王璋，司良毅，廖友斌.大鼠睡眠呼吸暂停综合征动物模型的建立［J］.中国实验动物学报，2006，14（1）：40-43.

［6］Kheirandish L，Row BW，Li RC，et al.Apolipoprotein E-deficient mice exhibit increased vulnerability to intermittent hypoxia-induced spatial leaming deficits［J］.Sleep，2005，28（1）：1355-1357.

［7］谭胜玉. 慢性间歇性缺氧对大鼠认知功能的影响及相关机制的研究 ［D］.长沙：中南大学，2007.

［8］Weston CR，Davis RJ.The JNK signal transduction pathway［J］.Curr Opin Cell Biol，2007，19（2）：142-149．

［9］Humar M，Loop T，Schmidt R，et al.The mitogen-activated protein kinase p38 regulates activator protein 1 by direct phosphorylation of c-Jun ［J］. Int J Biochem Cell Biol，2007，39（12）：2278-2288.

［10］Hui-guo L， Kui L， Yan-ning Z， et al. Apocynin attenuate spatial learning deficits and oxidative responses to intermittent hypoxia［J］. Sleep Med，2010，11（2） ：205-212.

（收稿日期：2012-06-03）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.01.010

作者单位：300052 天津，天津医科大学总医院呼吸内科（李琳、陈宝元）；唐山市中医院（刘志刚）；河北联合大学附属医院呼吸内科（王红阳）；

通信作者：陈宝元，Email：

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