高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸残留

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【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸的残留含量。方法 色谱柱：采用Hypersil ODS柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 检测波长210 nm， 流动相：0.08%磷酸溶液（Ph 3.0）-甲醇（95：5）， 流速1.0 ml/min，柱温：35℃。结果 三氟乙酸浓度在 2.05～12.12 μg/ml范围内， 线性关系良好， r=0.9998； 检测限为 1.0 ng；加样回收率平均为 98.57%， RSD 为 0. 99%。结论 此法可用于塞来昔布中三氟乙酸含量的测定， 准确度高。

【关键词】 塞来昔布；高效液相色谱法；三氟乙酸；含量测定

塞来昔布（4-[5-（4-甲基苯基）-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺）是第一个在骨关节炎和风湿病的治疗中起作用的COX-2抑制剂[1， 2]。这个药与传统的非类固醇性抗炎剂联用时无通常的副作用。GD Searle研发出了塞来昔布， 目前市场上商品名为西乐葆。

在塞来昔布的合成工艺中， 一般以对甲基苯乙酮和三氟乙酸乙酯经Claisen缩合反应制得中间体， 然后与对苯磺酰胺基苯肼盐酸盐化合制得塞来昔布。由于三氟乙酸乙酯会水解生产三氟乙酸， 因此在塞来昔布原料药的质量标准中， 对三氟乙酸限量有明确要求， 进口注册标准中规定三氟乙酸不得超过0.04%。本实验建立了高效液相色谱法（HPLC） 测定塞来昔布中三氟乙酸残留的方法。

1 材料

塞来昔布， 江苏正大清江制药有限公司提供， 批号： 20121029、 20121103、 20121109、 20121118；三氟乙酸对照品（ 色谱纯） ， 美国天地试剂有限公司；甲醇（ 色谱纯） ， 江苏汉邦科技有限公司； 其余试剂均为市售分析纯。美国Waters Alliance 2695 高效液相色谱仪， 2487紫外可变波长检测器， Empower 2色谱工作站。

2 方法与结果

2. 1 色谱条件 色谱柱： Hypersil ODS 柱（ 4.6 mm × 250 mm， 5 μm） ； 流动相： 0.08% 磷酸溶液（ pH 3.0） - 甲醇（ 95：5） ； 流速： 0.8 ml/min； 检测波长： 210 nm； 柱温： 35 ℃ ； 进样量： 20 μl。

2. 2 溶液配制

2. 2. 1 对照品溶液的配制 取三氟乙酸对照品适量， 精密称定， 加流动相溶解并制成每 1 ml 中含三氟乙酸10.1 μg的溶液， 作为对照品溶液。

2. 2. 2 供试品溶液的配制 取塞来昔布适量， 精密称定， 加流动相溶解并制成每 1 ml中含塞来昔布 25 mg 的溶液， 作为供试品溶液。

2. 3 测定方法 精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μl， 分别注入液相色谱仪。记录色谱图（ 见图 1） ， 按外标法以峰面积计算供试品溶液中三氟乙酸的含量。

A.对照品溶液 B. 供试品溶液

图 1 塞来昔布中三氟乙酸测定的HPLC色谱图

2. 4 加样回收率测定 用加样回收法， 精密量取供试品溶液 250 mg， 置10 ml量瓶中， 加流动相稀释至刻度， 摇匀， 作为回收试验用空白溶液（浓度为25 mg/ml） ，另精密量取塞来昔布样品250 mg分别用含三氟乙酸 8.08、10.10、12.12 μg/ ml的对照溶液溶解并定容到10 mL 量瓶中，释至刻度， 摇匀，作为回收率测定溶液， 按2.3项方法分别测定， 并计算回收率， 测定结果见表1。平均回收率为98. 57%， RSD（ n= 9） 为0.99%。

2. 5 线性范围 取三氟乙酸对照品适量， 精密称定， 加流动相溶解并分别稀释制成、2.02、4.04、6.06、8.8、10.10、12.12 μg/ ml的溶液， 依次进样20 μl， 记录色谱图， 以峰面积（Y）为纵坐标， 浓度（X， g/ml） 为横坐标， 进行线性回 归。回归方程： Y = 958.75X-90.07， r=0.9998， 线性范围为2.05～12.12 μg/ml。

2. 6 精密度测定 取塞来昔布（ 批号：20121029） 适量， 精密称定， 加流动相溶解并制成每 1 ml 中含塞来昔布25 mg的溶液，作为供试品溶液， 共配制 6 份， 按2.3项方法分别测定三氟乙酸的含量，均未检出。

2. 7 检测限 取三氟乙酸对照品适量， 精密称定， 加流动相溶解并稀释制成1.01 μg/ml 的溶液， 进行测定， 信噪比 S/N=3， 测得三氟乙酸的检测限为1.0 ng。

2. 8 塞来昔布中三氟乙酸含量测定取塞来昔布4批（ 批号： 20121029、 20121103、 20121109、 20121118） ， 按 2.3 项方法测定三氟乙酸的含量， 结果均未检出。

3 讨论

目前三氟乙酸含量测定的方法多采用气相色谱法[3]， 由于三氟乙酸的极性大， 酸性强， 对气相色谱柱损伤大， 分析成本较高， 且效果不是很理想。而用氧瓶燃烧法测定氟的含量[4， 5]， 操作繁琐且误差较大， 且塞来昔布样品本身含有氟元素干扰样品检测。另据报道[6]， 也可考虑用强酸型阳离子交换色谱柱测定三氟乙酸的含量， 本文采用 C18色谱柱分离测定塞来昔布中三氟乙酸的含量， 方法简便， 准确度高。在三氟乙酸对照品的配制过程中， 因三氟乙酸极易挥发， 故在称量过程中， 量瓶内应先加入适量流动相， 再加入三氟乙酸后需充分振摇， 使三氟乙酸充分溶解于流动相中， 减量法称样比较准确。

在整个试验过程中， 塞来昔布主峰未能洗脱出来， 多次进样尚未发现其对三氟乙酸测定有干扰， 因此， 应对色谱柱进行清洗后再保存。

参考文献

[1] Simon L S，Lanza F L，Lipsky P E，et al.Preliminary study of the safety and efficacy of SC-58635， a novel cyclooxygenase 2 inhibitor： efficacy and safety in two placebo-controlled trials in osteoarthritis and rheumatoid arthritis， and studies of gastrointestinal and platelet effects.Arthritis & Rheumatism， 1998， 41（9）： 1591-1602.

[2] Goldstein J L， Silverstein F E， Agrawal N M， et al. Reduced risk of upper gastrointestinal ulcer complications with celecoxib， a novel COX-2 inhibitor. The American journal of gastroenterology， 2000， 95（7）： 1681-1690.

[3] 孟静娟，单风平.气相色谱法测定液相合成蛋酸脑啡肽中杂质残留量.微生物学杂志，2008，28（ 3） ： 106 -108.

[4] 颜冬梅.人发中微量氟的测定.医疗保健器具， 2008， 15（9）：74-75.

[5] 张莉，晁若冰.有机药物中残留三氟醋酸测定方法的研究.华西药学杂志， 2001，16（6）：427-428.

[6] 高春，高恒莹，姚瑛，等.高效液相色谱法测定醋酸奥曲肽中醋酸含量.中国生化药物杂志， 2004， 25（4）：237 -238.