苦玄参褐斑病病原鉴定及致病因素分析
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摘要：为明确近年来引起广西梧州地区苦玄参（Picria felterrae Lour.）褐斑病的病原菌种类及致病因素，依据柯赫氏法则进行了致病性测定和病原菌验证，通过形态学观察、rDNA-ITS序列分析确定病原菌；通过对不同光照条件下病情调查，分析光照对该病害发生的影响。结果表明，病原菌形态特征与[Alternaria porri（ELL.）Ciferri]一致，其rDNA-ITS序列与GenBank中[Alternaria porri（ELL.）Ciferri]相似性达99%；强光利于病原菌菌丝生长、孢子产生及萌发。可见梧州地区苦玄参褐斑病病原菌为葱链格菌[Alternaria porri（ELL.）Ciferri]；光照是诱发苦玄参褐斑病的主要致病因素。
中图分类号：S482.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）16-3836-03
苦玄参（Picria felterrae Lour.）又名苦草、鱼胆草、四环素草、蛇总管，为玄参科苦玄参属植物，以全草入药，是《中华人民共和国药典》收载品种[1]，主要分布于广西、广东及云南等地，在广西民间作药用已有200多年的历史[2]。
苦玄参作为广西大宗、道地药材，是广西梧州制药（集团）股份有限公司生产的妇炎净胶囊的主要原料药材，也是广西多家制药企业生产的炎肿化毒片、炎见宁片、万通炎康片、维威消炎灵等多种中成药的原料药材[3]。随着医药市场需求的逐年增加，苦玄参在广西梧州地区广泛栽培。调查发现，近年来苦玄参褐斑病在梧州各栽培区普遍发生，造成叶斑、叶片枯黄，严重者叶片全部卷缩，植株枯死。国内外关于苦玄参病害的研究尚未见报道，褐斑病为首次报道的苦玄参病害。明确苦玄参褐斑病病原菌对于该病害的预防与控制具有重要意义。
环境因素对病害的发生流行起着重要作用，就光照与苦玄参褐斑病的关系进行探讨，可以阐明光照在该病害的发生中的作用，以指导生产。
1 材料和方法
1.1 病菌采样与分离、纯化
苦玄参褐斑病典型病叶采自广西梧州市岭角镇武烈村。病原菌的分离及纯化参照文献[4]。采集的病叶用清水洗净，剪取病叶组织（边长4～5 mm的正方形），用75%的乙醇消毒2～3 s，0.1%氯化汞消毒2 min，无菌水冲洗3遍，置于灭菌滤纸上吸干水，将病叶组织接种在马铃薯葡萄糖（PDA）琼脂培养基上，26 ℃恒温培养4 d，对分离物归类、编号。纯化培养采用单孢分离法纯化产孢真菌，采用多次挑取菌落边缘菌丝转皿纯化不产孢真菌，纯化后的真菌转管保存。
1.2 致病性测定[4]
将纯化菌株接种至PDA琼脂培养基，在28 ℃、相对湿度65%霉菌培养箱内培养5 d，用打孔器制备直径9 mm的菌饼。用无菌接种针在健康的离体苦玄参叶片上刺成面积约为1 cm2的伤口，用接种铲将菌饼接至伤口，保湿培养3～4 d，观察发病情况。根据柯赫氏法则，对发病叶片病菌进行再分离，显微镜下观察分离得到的病菌是否与原接种菌株相同。以接种PDA培养基作为对照，在室温（20～25 ℃）下保湿培养5 d，记录发病情况。
1.3 形态学鉴定
将致病菌株移至PDA平板上28 ℃下培养，玻片培养法观察，记载病原菌的形态特征，以病原菌菌落形态、病害症状为依据鉴定病原菌种属[4]。
1.4 核糖体rDNA-ITS序列分析
采用SDS法提取病原菌株的基因组DNA[5]。采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）（上海捷瑞生物工程有限公司合成）扩增该菌的rDNA-ITS序列。扩增产物的纯化和测序委托北京诺赛基因组研究中心有限公司完成，将得到的序列在GenBank中进行同源性比较[6]。
1.5 光照对病害的影响
选择除光照条件不同外，土壤、栽培管理等其他条件均一致的栽培地，采用LI-1400型便携式光量子辐射计分别测定各栽培地的光照强度。对不同光照条件下的苦玄参进行发病情况调查，每地块随机调查5个点，每个点查20株，每株调查10张叶片，调查叶片病级情况（分级标准见表1），统计发病株数及病情指数[7]。
病情指数=（各级病级代表值×该病级病叶数）/（调查叶片数×发病最重级代表值）×100。
2 结果和分析
2.1 病害症状
苦玄参褐斑病在广西梧州始于5月初，苗期可见症状发生，但为害不严重。6月下旬至8月是苦玄参的田间生长旺期，也是病害发生高峰期。多从靠近心叶的2～3片叶片开始发病，受害叶片初期病部呈水渍状淡黄小点，病斑不断扩大，形成不规则黄褐色斑块，大小为0.2～0.4 cm×0.5～0.8 cm，病健交界处为紫褐色（图1a）。天气或环境潮湿时，病叶呈水渍状；天气或环境干燥时病斑穿孔。后期病斑连片，病叶卷缩，呈火烧状。
2.2 病原菌鉴定
2.2.1 病原菌分离、纯化 患褐斑病苦玄参组织26 ℃恒温培养3～4 d后长出菌落，共分离到5株真菌菌株。
2.2.2 致病性测定 将分离所得的5株菌株室内接种至健康的离体苦玄参叶片上保湿培养5 d，仅K-1-2菌株接种的发病（图1a），其他未发病。发病叶片表现出明显的褐色水渍状斑点，对病叶进行病菌再分离接种，获得与原分离菌株一致的菌株。根据柯赫氏法则，确定试验中分离的K-1-2菌株为苦玄参褐斑病的病原菌。
2.2.3 病原菌的形态特征 菌株K-1-2在PDA琼脂培养基上的菌落呈圆形，有同心轮纹（图1b），初期菌丝白色，6～7 d后呈灰白色，菌丝颜色逐渐加深，从平皿背面观察到培养基的颜色逐渐加深至黑色。显微镜下观察，分生孢子梗单生或5～10个簇生，淡褐色有隔膜2～3个，不分枝或不规则稀疏分枝，大小为30～100 μm×4～9 μm，其上着生分生孢子。分生孢子褐色，常单生，直或略弯，倒棍棒状，或孢子本体椭圆形，至喙部（嘴胞）渐细，分生孢子具纵横隔膜5～15个，纵隔膜1～6个（图1c），大小为6～130 μm×15～20 μm，最长的可达300 μm，喙部直或弯曲，具隔膜0～7个，大小45～432 μm×2～4 μm。根据病原菌上述形态特征，参照文献[8，9]，发现符合半知菌亚门链格孢属葱链格孢[Alternaria porri（ELL.）Ciferri]的菌落和孢子特征，初步鉴定病原菌为葱链格孢。
2.2.4 病原菌核糖体DNA-ITS序列分析 采用通用引物ITS1/ITS4对苦玄参褐斑病病原菌菌株的rDNA-ITS序列进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，得到1个大小约为500 bp的片段；经序列测定确定该片段全长451 bp（图2），1～51 bp为部分18 S rDNA，52～201 bp为ITS1，202～351 bp为5.8 S rDNA，352～401 bp为ITS4，402～451 bp为部分5.8 S rDNA。将上述测序结果在GenBank进行同源性分析，得知该病原菌株与Alternaria porri（ELL.）Ciferri的同源性达99%。结合形态鉴定，确定该病原菌为Alternaria porri（ELL.）Ciferri。
2.3 光照强度对病害发生的影响
对不同光照条件下的苦玄参发病情况调查结果（表2）表明，苦玄参褐斑病随着光照强度的增加而加重。观察发现，全光照环境中种植的苦玄参，叶片病斑多、皱缩，植株较细小，分蘖不旺盛，生长后期不封行；设有一层遮阳网栽培的苦玄参，与不遮阳相比，发病率及病情指数均明显降低；在荫蔽的竹林边，苦玄参植株生长旺盛，茎秆粗壮，叶片厚且浓绿，生长后期封行。说明强光利于病原菌菌丝生长、孢子产生及萌发，光照过强是诱发苦玄参褐斑病发生的重要因素，光照强、温度高、湿度大极易造成褐斑病流行。
3 小结与讨论
链格孢属（Alternaria）真菌能侵染多种植物引起叶斑病，是植物叶部病害常见病原菌[10，11]。本研究在传统形态学鉴定的基础上，通过对苦玄参褐斑病病原菌的rDNA-ITS进行分析比对，从分子生物学水平上进一步明确了葱链格孢为苦玄参褐斑病的病原真菌。苦玄参是葱链格孢的新记录寄主。
苦玄参生长在热带、亚热带丘陵、山谷的雨林或季节性雨林下，是一种喜温暖湿润耐阴的植物[12]。近年来大面积扩植，很多直接种植在水田改的旱地里，日照时数及强度均大大增加，田间苦玄参褐斑病发生严重。本研究结果表明，光照是该病害的重要致病因子，建议在选择栽培地的时候重视遮阴条件，最好选择在自然荫蔽环境下种植（如林下），不仅满足遮阴条件而且较为阴凉、通透，不利于病害的流行。
参考文献：
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