Tca8113肿瘤微环境诱导小鼠髓源性树突状细胞免疫耐受性的研究
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【中图分类号】R73【文献标识码】 A【文章编号】1672-3873（2011）03-0019-03
【摘要】目的：tca8113肿瘤微环境诱导骨髓CD34+细胞分化为免疫耐受树突状细胞体外实验研究。方法：利用无菌小鼠长骨骨髓细胞，对照组在常规重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白介素-4（rmIL-4）培养液中培养，诱导分化为DCs，实验组在培养样体系中再加入舌鳞癌细胞株培养上清液，对照组不加任何干预因素。培养六天后加入（LPS）观察其对外源性刺激的反应,流式细胞术检测DCs表型CD86、CD11C、MHC-Ⅱ表达，混合淋巴细胞增殖实验比较其在体外刺激T淋巴细胞增殖能力。结果：tca8113肿瘤微环境不能抑制DCs成熟；tca8113-DC和LPS+tca8113-DC MCH-Ⅱ表达高于DC 和LPS+DC，p0.05; tca8113-DC刺激T淋巴细胞增殖的能力弱于对照组， p
Immune Tolerance of bone marrow-derived dendritic cell induced by Tumor Microenvironment of tca8113
Tong Xi , LI Yong , Li Xian , WANG Qi-ming , Wang Tao
（Dept of Oral and Maxillofacial Surgery , College of Stomatology , Chongqing Medical University，400015）
【Abstract】 Objective: To investigate immune tolerance of bone marrow-derived dendritic cell induced by tumor microenvironment of tca8113 . Materials & Methods: Culture supernatural of Tca8113 was collectd in vitro and then cooperate with rmgranulocyte-macrophage colony-stimulating(rmGM-CSF) and rminterleukin-4(rmIL-4) to induce DCs derived from C57BL/6 bone marrow，after 6 days DCs were stimulated by LPS for 24h.These DCs’ phenotype of cells was analyzed by flow cytometry，their ability to stimulate T lymphocyte proliferation were compared by mixed lymphocyte reaction in vitro. Results: Tumor microenvironment do not inhibit the mature of DCs；expression of MCH-Ⅱ of tca8113-DC and LPS+tca8113-DC is more then DC and LPS+DC p
Key words tumor microenvironment；dendritic cell；immune tolerance； immune suppressor
肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是指肿瘤在发生发展过程中所处的内环境，其中包括肿瘤细胞分泌的各种可溶性细胞因子[1-2]，近期研究结果表明，肿瘤微环境是导致肿瘤细胞获得免疫耐受的关键[3-4]。DCs是迄今为止发现的功能最强的抗原提呈细胞（APC）[5], 是机体获得性免疫的关键[6-7]。但目前关于肿瘤微环境对树突状细胞产生免疫耐受作用的影响的报道较为少见。本实验以舌鳞癌细胞株tca8113分泌可溶性因子模拟肿瘤微环境，旨在观察舌鳞癌微环境对诱导小鼠髓源性树突状细胞产生免疫耐受作用，并探讨其发生的机制。
1材料和方法
1.1 主要试剂及设备
重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF)、重组白细胞介素4（rmIL-4）、脂多糖（LPS）、丝裂霉素C、胰蛋白酶购于Sigma公司；抗小鼠PE-Cy5 CD11c，抗小鼠PE-CD86、抗小鼠FITC-MCH及同型对照试剂购于eBioscience公司；PBS、RPMI1640购于Hyclone公司；优质胎牛血清购于Gibico公司；PBS缓冲液购于Invitrogen公司。Tca8113细胞株购于四川大学口腔疾病研究国家重点实验室；流式细胞仪（BECTON DICKINSON FACSCalibur）；
1.2 实验器材
眼科剪，眼科镊，培养皿，巴氏管，离心管，玻璃培养瓶，200目细胞筛等。
1.3 实验动物
6-8周C57BL/6雌性小鼠，50只，28±3g，购于重庆医科大学实验动物中心。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准[8]。
1.4 实验方法
1.4.1 Tca8113培养上清液（culture supernatural of Tca8113 cells，cs-Tca8113）制备
收集对数生长期Tca8113细胞株置于含10％胎牛血清RPMI1640培养基中配成1×106/ml细胞悬液，4ml/瓶分装于50ml培养瓶，置37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养，待培养瓶中细胞铺满瓶底80％，改用无血清培养基培养48h后收集培养上清液，离心、分子筛过滤后于-80℃恒温保存备用。
1.4.2 骨髓CD34+细胞制备
参考lutz [9]等方法并加以改进。C57BL/6小鼠脱颈法处死，无菌条件下取出股骨，75％酒精浸泡消毒60s，RPMI-1640培养液反复冲洗骨髓腔，直至股骨发白。得到骨髓细胞，加入37 ℃预温的红细胞裂解液(氯化铵裂解液)，静置2分钟，离心1000r/min，2min，弃上清，加入PBS液混匀，再离心1000r/min，3min,两次，收集沉淀的骨髓CD34+细胞备用。
1.4.3 树突状细胞培养
将收集到的小鼠骨髓细胞以含10μg/ml rmGM-CSF+10μg/ml rmIL-4的10％胎牛血清RPMI1640培养液配成2×109/L骨髓细胞悬液，6ml/瓶接种于50ml培养瓶。将其分为实验组（tca8113-DC）：培养体系中再加入含 cs-Tca8113 1.4ml；对照组（DC）：不加任何干预因素。所有细胞置37℃、5％CO2，饱和湿度条件下培养48h换液，仅保留贴壁细胞，同时再加入培养液实验组加入含培养液6ml；实验组再加入1.4mlcs-tca8113；之后隔日半量换液，实验组额外补入3ml培养液+0.7ml cs-Tca8113；培养至第六天收集悬浮细胞计。每组取1/3细胞送流式细胞仪检测，每组剩余2/3细胞10％胎牛血清RPMI1640 4ml重悬后接种于20ml培养瓶，同时加入LPS至10μg/ml，继续所有细胞置37℃、5％CO2，饱和湿度条件下培养24小时后，收集各组悬浮细胞（LPS+DC、LPS+tca8113-DC），送流式细胞仪检测及混合淋巴细胞反应。
1.4.4 DCs表型CD11c、CD86、MCH-Ⅱ检测
于培养第六天收集各组悬浮细胞部分送流式细胞仪检测，部分细胞加入LPS培养24小时后送流式细胞仪检测
1.4.5 混合淋巴细胞反应
制备C57BL/6小鼠脾细胞悬液，用淋巴细胞分层液李显获得单核细胞，尼龙毛刷吸附获得T淋巴细胞，与经50微克/ml丝裂霉素C灭活的各组DC（2×105/孔）以不同浓度梯度混合培养与96孔原地细胞培养板中（含10％胎牛血清RPMI 1640培养液），并设置阴性对照和无细胞空白对照，混合培养48h后在待测空中加入MTT液（5mg/ml），4h后吸去培养液和MTT混合液，加入DMSO液150 ul，酶标仪检测每孔OD值，波长设为570nm。刺激指数(SI)=（各测试孔OD值 -空白对照OD平均值）/（阴性对照组OD值-空白对照组OD值）
1.5 统计学处理
实验数据均以±s表示，两组数据的比较采用t检测，所获得数据用统计软件SPSS 13．0分析，计算P 值, P < 0. 05为差异具有统计学意义。
实验结果
2.1 舌鳞癌肿瘤微环境对髓源性小鼠DCs的分化和成熟影响
实验组、对照组CD11c表达无明显差异p>0.05，说明肿瘤微环境不抑制骨髓CD34+细胞分化为DCs；tca8113-DC、 LPS+tca8113-DC MCH-Ⅱ、DC 和LPS+DC 组MCH-Ⅱ+CD86 表达无统计学意义 p>0.05,说明肿瘤微环境不抑制DCs 成熟；对照组DC经LPS刺激前后,MCH-Ⅱ+CD86表达增加 p
肿瘤微环境抑制髓源性小鼠树突状细胞刺激T淋巴细胞增殖能力
对照组DC刺激T淋巴细胞增殖SI=2.86±0.29,，经LPS刺激后LPS+DC诱导T细胞增殖活性明显提高SI=4.02±0.09 p
Fig 2 Change of T lymphocyte proliferation index after different measurements(±s ，n=5)
3. 讨论
DCs在口腔颌面部肿瘤免疫应答中起重要的作用，与肿瘤的进展有密切关系。DCs在分化过程中经历了从未成熟DC（immature DC，imDC）和成熟DC（mature DC，mDC）两种不同阶段[10-11]。不同发育阶段DCs的表型与功能密切相关：imDC低表达MCH-Ⅱ同时不表达或者低表达CD40、CD86等共刺激分子，诱导免疫耐受[12]；而mDC则高表达CD86和MCH-Ⅱ，具有强抗原呈递能力,诱导T细胞增殖[13]，形成免疫应答。正常人体内imDC经外源性或内源性抗原激活后转化为mDC。DCs的免疫耐受性来源于：imDC与调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）接触后上调其表面抑制性分子ILT3、ILT4表达，抑制T细胞增殖，从而发挥出免疫耐受功能[14]。
本实验结果显示：肿瘤微环境不能抑制DCs成熟，但能够促进CD34+细胞分化为tca8113-imDC，且肿瘤微环境下生成tca8113-imDC具有抵抗LPS刺激成熟能力；Tca8113-DC刺激T淋巴细胞增殖能力显著弱于正常DCs，这说明，肿瘤微环境下培养DCs具有致免疫耐受性；肿瘤微环境下分化tca8113-imDC与imDC相比具有相对稳定的发育状态，表明肿瘤微环境下imDC免疫耐受性具有稳定性。结合王志勇[15]等临床对照研究结果：肿瘤组织内DCs存在功能缺陷，由此推测肿瘤微环境诱导树突状细胞致免疫耐受性可能是恶性肿瘤细胞免疫逃逸的关键。
肿瘤微环境诱导小鼠DCs产生免疫耐受的可能机制：肿瘤微环境内有肿瘤细胞分泌各种异常量免疫抑制因子，目前已知头颈部恶性肿瘤细胞分泌免疫抑制因子包括转换生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、一氧化氮合酶（NOS）等；TGF-β1是目前研究较为深入的免疫抑制因子：体外细胞实验表明骨髓CD34+细胞在加入TGF-β1培养时能够抑制DCs成熟而停留在未成熟状态，即使培养中加入外源性抗原刺激，这些DCs也不再成熟 [16]，同时其他免疫抑制因子协同作用，诱导树突状细胞产生免疫耐受性。
综上所诉，tca8113肿瘤微环境诱导DCs产生免疫耐受性，并且其免疫耐受性能较为稳定和持久，不易为外源性或者内源性抗原阻断。本研究结果丰富了肿瘤免疫逃逸机制，并为肿瘤免疫治疗提供了新的思路。
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