白灵侧耳水渍状斑点病初探

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近几年白灵侧耳（Pleurotus nebrodensis）水渍状斑点病（wet blotch disease）频繁发生，对罹病样品进行显微观察和病原菌分离，并对附生优势菌株进行分子鉴定和致病性研究。结果表明，在水渍状病变组织内未发现和分离到细菌和其它真菌；病斑表面的附生优势菌株L1和F1分别为Pseudomonas sp.和Arthrobacter sp.，回接试验检测无致病性，初步推断该病害不是由细菌或真菌侵染引起的。

白灵侧耳（白灵菇）； 水渍状斑点病； 食用菌

白灵侧耳（Pleurotus nebrodensis）又称白灵菇，我国于20世纪80年代人工驯化栽培成功［1, 2］，90年代中后期开始商业化栽培，发展迅速，至2010年我国白灵侧耳的年总产量已经达到30万吨，成为我国重要的特色珍稀食用菌之一。随着白灵侧耳栽培规模的扩大，病害也日益严重。笔者对天津市蓟县白灵侧耳生产调查时发现，一种典型症状为菌盖表面出现水渍状斑点的病害（以下简称水渍状斑点病，wet blotch disease），在一般菇房中发生率在60%～80%，通常不影响产量，但是严重降低子实体品质，给白灵侧耳生产造成很大损失。

目前已报道的食用菌斑点病（blotch disease）多数是细菌性病害，如双孢蘑菇（Agaricus bisporus）褐斑病（brown blotch disease）、黄斑病（yellow blotch disease）和姜黄色斑点病（ginger blotch disease）的病原分别是托拉斯假单胞菌（Pseudomonas tolaasii）［3］、姜黄色假单胞菌（P. gingeri）［4, 5］和蘑菇假单胞菌（P. agarici）［6］。目前尚没有关于白灵侧耳水渍状斑点病的研究报道。以期为明确白灵侧耳水渍状斑点病发病原因提供参考，笔者在河北省遵化市和天津市蓟县的白灵侧耳生产基地进行发病程度和发病规律调查，并采集样品，在实验室内对病害进行发病原因初步分析，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1病害调查

河北省遵化市平安城镇和天津市蓟县出头镇均是我国白灵侧耳主产区，该地区白灵侧耳的主栽品种是“中农 1号”和“ACCC 50869”，一般在8月中下旬制袋，栽培主要原料为棉籽壳和木屑，采用砌泥墙模式出菇，常规方法管理［7］。在出现水渍状斑点病过程中均未采取药剂或特殊的防治措施。随机选择平安城镇平一村和出头镇中峪村各3个白灵侧耳生产大棚，每个菇棚栽培“中农1号”8000袋左右，“ACCC 50869”2万袋左右。本研究对这6个菇棚进行水渍状斑点病发病情况调查，采用直接计数法记载发病率［8］。

1.2样品采集

从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所实验菇房（I组）、平一村（II组）和中峪村（III组）生产大棚采集3组带有水渍斑点的新鲜子实体样品，带回实验室进行病原研究。

1.3病原分析

1.3.1显微镜检查

从3组样品中，每组随机取3个罹病子实体，对病变组织和健康组织进行切片；组织切片加盖盖玻片后，适当按压，用显微镜（Olympus BX51）40倍物镜观察菌丝的粗细、分枝和锁状联合等形态特征；组织切片放在玻片上的水滴中，加盖玻片轻压后，立即放在显微镜40倍物镜下检查是否有混浊的细菌溢流出；将切片移走，水滴干燥后通过火焰固定，革兰氏染色观察。

1.3.2分离培养

1.3.2.1 细菌的分离

每组样品随机取3个罹病子实体，分别选择一个病斑进行细菌的分离。首先用70%的酒精表面消毒后，把子实体沿病斑边缘掰开，将表皮组织用灭菌的解剖刀切去，然后切取每边约 3 mm的水渍状病变组织块，置于200 μL灭菌水中，用灭菌玻璃棒研碎，静置10 min，用灭菌的移植环蘸取悬液在R2A琼脂培养基（BD DifcoTM）平板上划线接种，将培养皿倒置，25 ℃培养，观察菌落生长情况。

1.3.2.2 真菌的分离

每组样品随机取3个罹病子实体，分别选择一个病斑进行真菌分离［8］。切取每边约3 mm的水渍状病变组织块接种到PDA平板上，25 ℃培养，观察菌丝萌发及菌落生长情况。

1.3.2.3 斑点表面附生细菌的分离

每组样品随机取3个罹病子实体，分别选择一个病斑进行附生细菌的分离。用无菌的解剖刀切取一块3 mm×3 mm的表皮组织，置于装有500 μL无菌水，采用涡旋振荡法分离附生细菌，梯度稀释法制作浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 的稀释悬液［9］。分别取100 μL悬液涂布于R2A琼脂培养基平板上，25 ℃培养，观察24、48、72和96 h菌落生长情况。

1.4分离菌株的分子鉴定

挑取纯化后的细菌菌体，置于200 μL TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L EDTA, pH = 8.0）中振荡1 min，10000 g离心5 min，收集沉淀；加200 μL TE缓冲液振荡30 s，离心 5 min，收集沉淀；再加入200 μL TE缓冲液振荡30 s，沸水浴10 min；然后10000 g离心5 min， 收集上清液作为模板DNA。使用通用引物fd2（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和rp1（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）［10］扩增16S rDNA。PCR反应体系为50 μL，其中 10×PCR缓冲液5 μL， dNTP（2.5 mmol/L） 2 μL，正向和反向引物（5 μmol/L）各2 μL，Taq DNA聚合酶［宝生物工程(大连)有限公司］1 U，模板DNA 2 μL。PCR反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36个循环； 72 ℃ 7 min。 PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。利用试剂盒［Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Version 2.0，宝生物工程(大连)有限公司］按照说明书切胶纯化PCR产物，然后由上海英骏生物技术有限公司利用引物fd2和rp1进行测序。