施氮对大穗型两系杂交水稻弱势粒碳氮代谢的影响
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摘要：以2个大穗型两系杂交水稻品种培杂67和培杂88为材料，研究3种不同施氮水平（LN.90 kg/hm2，MN.180 kg/hm2，HN.270 kg/hm2）对大穗型两系杂交水稻弱势粒碳氮代谢的影响。结果表明，与正常施氮相比，过量施氮提高了子粒谷氨酰胺合成酶活性，促进了可溶性蛋白质的生成，但降低了弱势粒中蔗糖的含量和蔗糖合成酶的活性，减少了淀粉积累量，最终降低了弱势粒粒重；施氮量过少则降低了弱势粒蔗糖含量、蔗糖合成酶和谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致弱势粒中的淀粉和可溶性蛋白质的积累量减少，弱势粒的充实度降低；施氮量对强势粒充实度影响不大。
关键词：氮素水平；大穗型两系杂交水稻；弱势粒；碳氮代谢
中图分类号：S511.062 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）08-1755-05
水稻是世界上重要的粮食作物之一，提供给世界人口近60%的粮食需要，而子粒灌浆是水稻生长的重要生理过程，直接影响到水稻的产量和品质，因此水稻子粒灌浆问题的研究已成为当今农业领域的一个研究热点[1-4]。由于水稻在子粒发育过程中花序上颖花的分化和发育顺序不一，所以强势粒与弱势粒在灌浆上存在差异[5]。强势粒发育早、充实度好、粒重高，而弱势粒发育迟、充实度差、粒重低。特别是对于大穗型的品种，由于穗型过大，弱势粒不但受上部强势粒的高度抑制，还受到大量中部子粒的抑制，所以充实度差和粒重低的问题更加突出[2，3]，它不仅限制了水稻产量潜力的发挥、严重影响稻米品质，还影响了水分和养分的高效利用。因此，深入系统地研究弱势粒充实问题，对于实现水稻高产、稳产和高效具有十分重要的理论和实践意义[6]。
一般而言，子粒粒重的高低主要受品种遗传因素的制约，但环境条件及栽培技术措施对其也有很大的影响。施氮是水稻栽培的重要技术措施，合理有效地施肥对水稻生长发育及子粒灌浆具有重要的作用[7-9]。已有研究表明，适量施氮可以提高子粒形成期叶片的叶绿素含量和光合作用，延缓叶片的衰老，增加子粒灌浆物质的供应，增加粒重，最终达到提高水稻单产的目的[10，11]。侧重前期施氮有利于提高淀粉合成酶活性[12]，而侧重后期施氮则不仅有利于水稻维持灌浆速率和较长的灌浆时间[13]，而且可以提高ADPG焦磷酸化酶和淀粉分支酶活性[12]。尽管前人围绕子粒进行了大量研究，但有关氮素对水稻弱势粒碳氮代谢影响的报道较少。为此，选取2个大穗型两系杂交水稻品种，探索施氮水平与弱势粒碳氮代谢之间的关系，从而为氮肥的合理施用、提高水稻产量和氮肥利用率提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验在华南农业大学试验基地进行，供试的两个大穗型两系杂交稻品种为：培杂67（250粒/穗）和培杂88（220粒/穗）。氮肥采用尿素（含氮量46%）。试验地前茬作物为水稻，土壤0～20 cm耕层pH 7.70，全氮1.18 g/kg，碱解氮175.40 mg/kg，速效磷105.27 mg/kg，速效钾189.45 mg/kg。
1.2 试验方法
试验采用随机区组设计，两个品种、3个施氮水平共6个处理，每个处理3次重复，共计18个小区。小区面积20 m2，各小区均筑埂并用塑料薄膜深埋护埂，严防肥水漏窜。种植规格为株距23 cm，行距16 cm，每穴1苗。
3个施氮量处理为：低氮（LN）90 kg/hm2；中氮（MN）180 kg/hm2；高氮（HN）270 kg/hm2，施用肥料为尿素（含氮量为46%），其中基肥、分蘖肥、保花肥按1∶6∶3的比例施用。肥料施用方式为：基肥在移栽前3 d施入，分蘖肥在移栽后5 d施入，保花肥在幼穗分化2期和5期按照3∶2的比例施入。
各处理配施等量的磷、钾肥，即每公顷施过磷酸钙750 kg、氯化钾675 kg，分别折合P2O5 90 kg/hm2、K2O 405 kg/hm2，其中磷肥全部作基肥，钾肥在分蘖期和幼穗分化期施入，其他管理同当地大田管理一致。
1.3 样本标记及取样
于开花期标记长相一致、同一日开花的弱势粒小花[14]。以群体盛花期后3 d记为取样日期，在花后0～24 d内每6 d取样一次。用于测定可溶性蛋白质含量、谷氨酰胺合成酶（GS）活性、蔗糖合成酶（SS）活性、蔗糖和淀粉含量。
1.4 测定项目与方法
1.4.1 子粒充实度测定 成熟期每小区选取10株稻穗，分别收集每穗的强、弱势粒[14]，参照朱庆森等[15]的方法测定谷粒充实度。谷粒充实度=（受粒的平均子粒质量/密度大于1的饱满子粒的平均子粒质量）×100%，计算强、弱势粒充实度。
1.4.2 蔗糖、淀粉和可溶性蛋白质含量的测定 蔗糖含量采用间苯二酚法测定[16，17]。淀粉含量采用蒽酮硫酸法测定[16，17]。可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定[17]。
1.4.3 蔗糖合成酶（SS）活性测定 取冻存的去壳子粒或叶片0.2～0.5 g，加入液氮，再加入5 mL提取介质（50mmol/L Hepes、5 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、2 mmol/L KCl、1%PVP、pH 7.5）研磨成匀浆，在10 000 r/min、4 ℃下离心10 min，上清液即为酶液。在总体积0.15 mL反应混合液中（50 mmol/L Hepes、pH 7.0、10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L果糖、3 mmol/L UDPG）加入一定量酶液，30 ℃水浴反应10 min后，加入0.05 mL 2 mol/L NaOH，沸水中煮10 min，流水冷却，再加入0.7 mL 30%HCl及0.2 mL用95%乙醇配制成0.1%的间苯二酚，摇匀后置于80 ℃水浴保温10 min，冷却后于480 nm下比色测定蔗糖的生成量，然后用蔗糖生成量（mg）/[鲜重（g）×时间（h）]表示SS活性[17]。
1.4.4 谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定 取冻存的去壳子粒或叶片0.2～0.5 g，加入液氮，然后加入5 mL提取介质（0.05 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0、2 mmol/L MgSO4、2 mmol/L DTT、0.4 mol/L蔗糖）研磨成匀浆，在15 000 r/min、4 ℃下离心20 min，上清液即为酶液。在1.6mL反应混合液B（80 mmol/L MgSO4、20 mmol/L谷氨酸钠盐、2 mmol/L EGTA、pH 7.4）中，加入0.7 mL酶液和0.7 mL ATP，混匀，于37 ℃下保温30 min，加入显色剂（0.2 mol/L TCA、0.37 mol/L FeCl3、0.6 mol/L HCl）1 mL，摇匀并放置片刻后于5 000 r/min 下离心10 min，取上清液测定540 nm下的吸光度，并以加入1.6 mL反应液A（80 mmol/L MgSO4、20 mmol/L谷氨酸钠盐、2 mmol/L EGTA、80mmol/L盐酸羟胺、pH 7.4）为对照。GS活性=A/（P·V·t），式中A为540 nm处酶液与对照吸光度之差，P为粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/mL），V为反应体系中加入的粗酶液体积（mL），t为反应时间（h）[17]。
1.5 数据分析
采用SPSS 10.0软件进行方差分析和多重比较，用Originpro 7.5作图。
2 结果与分析
2.1 施氮量对水稻子粒充实度的影响
两个品种不同处理间强势粒充实度差异不大，但弱势粒充实度则表现出相当大的差异（表1），其中以中氮处理（MN）最高，高氮处理（HN）最低。从强、弱势粒充实度差值来看，以中氮处理最小（平均38.53个百分点），高氮处理最大（48.18个百分点）。结果表明，适度施氮缩小强、弱势粒充实度的差距，促进了同化物向弱势粒输入，最终提高了子粒的充实度，而施氮量过高或过低均不利于提高弱势粒充实度。
2.2 施氮量对水稻弱势粒碳代谢的影响
2.2.1 施氮量对水稻弱势粒蔗糖含量的影响 由图1a、图1b可知，水稻弱势粒蔗糖含量随着时间的推移呈现下降的趋势，其中在花后12～18 d下降幅度最大，两个品种不同处理表现一致。施氮量对弱势粒蔗糖含量有较大影响，不同施氮水平间比较，在花后6～12 d，MN处理的蔗糖含量显著高于HN和LN处理，高、低氮肥处理之间的差异不显著，两个品种表现一致，说明MN处理明显增加了源器官对水稻弱势粒光合同化物的供应。
2.2.2 施氮量对水稻弱势粒淀粉含量的影响 由图2a、图2b可知，水稻弱势粒淀粉的快速积累期出现在花后12～18 d，在此之前和之后，淀粉积累缓慢。方差分析表明，在花后6～12 d，不同施氮水平之间弱势粒的淀粉含量无显著差异，而花后12 d以后，MN处理的弱势粒淀粉含量显著高于HN和LN处理，导致这种情况的原因可能是高氮处理延长了灌浆过程的缓增期，低氮处理容易造成叶片早衰，导致源不足，致使灌浆过程的淀粉积累和子粒充实度受到明显的影响。
2.2.3 施氮量对水稻弱势粒蔗糖合成酶活性的影响 蔗糖合成酶是直接参与蔗糖代谢的调节酶，其活性高低直接影响子粒蔗糖的输入。由图3a、图3b可知，水稻弱势粒蔗糖合成酶活性的快速上升期出现在花后12～18 d，在此之前和之后，酶活性变化趋势较为平缓。不同施氮水平比较， MN处理的弱势粒蔗糖合成酶活性在花后12～24 d显著高于LN和HN处理，LN和HN处理间的差异不显著。表明过高或过低的氮肥施用抑制了蔗糖合成酶的活性，并且在果聚糖降解、蔗糖快速合成运转期，其没有起到积极的调节作用。子粒蔗糖合成酶活性变化趋势与淀粉含量的变化趋势是相符的，即酶活性越高，淀粉含量增加也快。
2.3 施氮量对水稻弱势粒氮代谢的影响
2.3.1 施氮量对水稻弱势粒可溶性蛋白质含量的影响 水稻弱势粒可溶性蛋白质含量变化与淀粉含量变化趋势基本上是一致的，在子粒灌浆初期，可溶性蛋白质含量的增加较慢，于花后12～18 d快速上升，而后增幅趋缓（图4a、图4b）。不同施氮水平比较，花后6～12 d，3种施氮水平可溶性蛋白质差异不显著，花后12 d以后，LN处理的可溶性蛋白质积累明显低于HN和MN处理。HN处理略高于MN处理，但二者之间差异不显著。两个品种表现一致。可见子粒可溶性蛋白质的积累与淀粉的积累有相似的特征，而这两种物质是子粒储存物质的主要成分，因此它们在子粒中的积累过程反映了子粒的灌浆特征。
2.3.2 施氮量对水稻弱势粒谷氨酰胺合成酶活性的影响 水稻弱势粒灌浆过程中，两个品种子粒谷氨酰胺合成酶活性变化趋势基本一致（图5a、图5b），表现为在灌浆初期活性上升缓慢（花后6～12 d），然后快速提高（花后12～18 d），最后趋缓（花后18～24 d）。不同施氮水平比较，花后6～12 d，施氮水平之间的差异不显著。在花后12～24 d，谷氨酰胺合成酶活性表现为HN>MN>LN，LN处理的谷氨酰胺合成酶活性明显低于HN和MN处理，HN和MN处理间的差异不显著，两个品种表现一致。说明谷氨酰胺合成酶活性变化趋势与弱势粒可溶性蛋白质含量的变化趋势是相符的，即谷氨酰胺合成酶活性上升，可溶性蛋白质含量增加，与LN处理相比，HN处理和MN处理有利于促进弱势粒灌浆中后期可溶性蛋白质的积累。
3 结论与讨论
弱势粒灌浆慢、结实率低、充实度差，是限制水稻产量和品质的一个重要因素[18]。研究发现，与正常施氮相比，过量施用氮肥提高了水稻弱势粒谷氨酰胺合成酶活性，促进了可溶性蛋白质的合成，但降低了弱势粒中蔗糖的含量和蔗糖合成酶的活性，减少了淀粉积累量，最终降低了弱势粒粒重；施氮量过少则降低了弱势粒蔗糖含量、蔗糖合成酶和谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致弱势粒中的淀粉和可溶性蛋白质的积累量减少，弱势粒的充实度降低。施氮量对强势粒充实度影响不大。
碳、氮代谢是植物体内最基本的两大代谢过程，它与作物的产量、品质有密切联系[19]；施氮对水稻灌浆的影响实质上是通过氮素影响碳、氮化合物的合成、运转、转化及合成关键酶活性等来实现的。前人研究[20-22]表明，氮肥对水稻子粒的增重过程和最终粒重影响较大，合理增施氮肥和增加穗粒肥比例可以促进根系氮素代谢，延长叶片的功能期，提高叶片和子粒的全氮、蛋白氮和非蛋白氮含量以及谷氨酰胺合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性，延缓叶片的衰老，增强茎鞘储存及运转能力，增加灌浆物质的供应，提高灌浆速率，并最终提高产量，但氮肥施用过量，会抑制叶片蔗糖磷酸合成酶活性和蔗糖合成酶及ADPG焦磷酸化酶活性，不利于叶片的蔗糖合成和子粒的淀粉合成，从而导致产量下降。
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