IrrE基因转化甘蓝型油菜及其分子检测

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摘要：为提高油菜的盐胁迫的耐受性，文章以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）下胚轴为转化材料，通过农杆菌介导法将耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans，DR)的irre基因导入甘蓝型油菜84100-18（玻里马细胞质雄性不育恢复系）中，经过卡那霉素的筛选培养，获得了抗卡那霉素的再生植株，对抗性植株进行PCR和实时荧光定量PCR检测。结果表明：部分抗性植株多次重复检测显示为阳性植株，初步证实了IrrE已整合到油菜基因组中并且IrrE基因已经在这些植株中进行mRNA水平的转录。

关键词：甘蓝型油菜；遗传转化；PCR检测

中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-09-0041-2

甘蓝型油菜（Brassica napus L.）属于十字花科芸苔属植物，是全世界较为重要的一种油料栽培作物。它作为重要的食用油来源及工业原料，在2000年度我国油菜籽进口量一度创下385.5万吨的历史最高纪录。扩大油菜种植面积，提高油菜产量已成为我国油菜生产的当务之急。但是，土壤的盐渍化已经使油菜产业的可持续发展受到严重阻碍，而油菜整个生长发育期中对盐胁迫都很敏感。因此，培育耐盐油菜品种是解决油菜生产的重要途径。

IrrE基因是耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans，DR)基因组中的一个突变基因(又命名为PprI)，是一个能够促进细胞体内RecA、PprA等直接参与DNA损伤修复基因表达的开关基因[1,2]。该基因表达的IrrE蛋白是DNA修复及保护途经的总开关，该基因在大肠杆菌（E.coli.）中为组成性表达，大肠杆菌能忍受 0.65 mol.L-1 NaCl胁迫，并能正常生长[3]。

为了增强油菜的盐耐受性，我们以来源于耐辐射异常球菌的IrrE基因为外源基因，以油菜下胚轴为转化材料，采用农杆菌介导的遗传转化方法，对甘蓝型油菜进行转化，获得转IrrE基因的油菜。通过PCR技术进行阳性苗的分子鉴定，荧光实时定量PCR检测其转录水平的表达，结果表明IrrE基因已经成功导入甘蓝型油菜并在其中进行mRNA水平的转录。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料 转IrrE基因的大肠杆菌（Escherichia coli）IrrE-DH5α和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）IrrE-EHA105菌株由中国农业科学院植物生物技术研究中心微生物实验室提供。甘蓝型油菜（Brassica napus）84100-18（玻里马细胞质雄性不育恢复系）由四川大学遗传学实验室提供，在本实验室温室中栽种。

1.1.2 主要试剂 TaqDNA聚合酶，反转录试剂盒等均购自于均购自TaKaRa 公司，引物由上海生物工程公司合成，无DNA的RNA提取试剂盒购自于上海华舜生物有限公司，Cab由北京普博欣生物科技有限责任公司提供，kan由Bio BASIC INC 提供，利福平由成都锦华药业有限责任公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 根癌农杆菌介导油菜的遗传转化 选取籽粒饱满的油菜种子用无菌水浸泡10min，再用75%酒精消毒1min，用无菌水冲洗2-3次，在用1%的升汞消毒12min，用无菌水冲洗2-3次，接种于无激素的MS培养基上。光照培养5d，剪下油菜苗的子叶和生长点，取紧接生长点的约0.5cm长的下胚轴，置于预培养基（含6-BA 2.0mg/L、2，4-D 1.0mg/L、AgNO3 2.5 mg/L、AS 100uM）上预培养培养2天。

在50ml LB培养基（含Rif 40mg/L、str 20mg/L、Kan 50mg/L）中加入0.1 ml IrrE-EHA105菌液，220rpm，28℃振荡培养过夜；室温下5000g，10min，弃上清液，菌体用MS液体培养基（含AS100uM）悬浮，再220rpm，28℃振荡培养1hr，使菌液的OD600=0.5左右。将经过预培养2天的下胚轴在农杆菌液中浸泡1 min ，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于覆盖有灭菌滤纸的预培养基上，23℃暗培养2d。共培养2天后的下胚轴接种至筛选培养基（6-BA 2.0mg/L、AgNO3 2.5mg/L、Kan 10mg/L、Cab 500mg/L）上筛选培养，每两周转继一次，经过4轮筛选培养，再生出小苗。再生小苗长有三片真叶时将其从愈伤组织上将其剪下，接种至含NAA 0.15mg/L和Cef 250mg/L的1/2MS培养基中生根。

1.2.2 转基因植株的PCR检测 采用CTAB法，分别从转基因植株和非转基因植株叶片中提取总DNA，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。以pMD-18质粒上的目的片段为阳性对照，以未转化油菜的总DNA为阴性对照，对转化油菜的DNA样品进行PCR 扩增检验。目的基因IrrE的PCR检测所用一对的引物，其序列分别为5’CAACGTCATCCTCATCAACTC（P1），5’TCCACCTCCGCCTTCATTT（P2）扩增片段大小为398bp，引物由上海生工公司合成。反应程序：94℃变性2min后进入循环，94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s，35个循环，72℃延伸10min，PCR扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测 取阳性油菜和阴性对照油菜的幼嫩叶片0.1g，采用上海华舜生物技术有限公司柱式小量DNA-free植（叶）总RNA抽提试剂盒提取叶片总RNA，在以mRNA为模板进行反转录。反转录采用TaKaRa的反转录酶及Oligo（dT）18，反转录出mRNA的cDNA第一链，作为定量PCR的样品模板。以含IrrE基因和b-actin基因的质粒DNA作为定量PCR的标准品，紫外分光光度检测质粒A260吸光值，根据质粒分子量计算质粒浓度（拷贝/ul），将标准品梯度稀释（108、107、106、105、104、103、102coples/ul）作为模板进行实时定量PCR反应，制作标准曲线。用IrrE及b-actin引物进行反应，IrrE上游引物序列：5’-ACGCTGGCCCAAGCACAGAAA-3’，下游引物序列：5’- CGTCCACCTCCGCCTTCATTTT-3’；B-actin上游引物序列：5’ ACTGTGCCAATCTACGAGGGTT-3’，下游引物序列：5’-TCTTACAATTTCCCGCTCTGCT-3’。25ul反应体系包括：2 x Mix 12.5ul（包括反应缓冲液、dNTP、MgCl、SYBR Green、Taq酶），上下引物各0.5ul，稀释的重组质粒DNA或反转录的模板DNA 1ul。定量PCR反应程序为：94℃变性2min后进入循环，94℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 20s，72℃采集荧光，40个循环，72℃彻底延伸5min，95℃彻底变性1min，55℃延伸1min，55℃开始做溶解曲线分析，每30s增加一个循环，共81个循环。

2 结果

2.1 转基因油菜植株的获得

油菜下胚轴外植体经过EHA105浸染和共培养后，在筛选培养基上先形成愈伤组织（如图1A），再在愈伤组织上分化出再生小苗（如图1B），再生小苗在含有卡那霉素的筛选培养时，非转基因小苗在会形成白化苗；将长势良好的再生小苗接种于生根培养基进行生根培养（如图1C），在生根培养基中，再生小苗长出不同的侧根。

2.2 转基因油菜的PCR检测

用引物P1、P2对转基因植株叶片DNA进行三次重复PCR扩增。在相同的植株中都得到了预期分子量398bp的条带，与阳性对照扩增出的条带完全相同，而未转化的油菜DNA则未扩增出相应的条带（如图2），说明外源目的基因IrrE已经插入到油菜基因组中。

2.3 油菜RNA质量检测

实验取5µl提取的样品在1%的琼脂糖凝胶上进行快速电泳检测（如图3），检测结果表明该RNA样品可以进行反转录。

2.3 IrrE基因的实时荧光定量检测

用b-actin和IrrE的引物对反转录cDNA样品进行实时荧光定量PCR扩增检测，b-actin基因作为内参，IrrE基因在不同的阳性株系中都有表达，且不同的株系表达量不同（如图），表明了IrrE基因已经在mRNA水平的转录。

3 讨论

随着分子生物学的技术进步，目前已使基因的定位、克隆、转移成为现实，植物耐盐的分子生物学和植物耐盐基因工程在提高农作物耐盐能力方面正起着越来越重要的作用。植物基因工程是在基因水平上来改造植物的遗传物质，更具有科学性和精确性，同时育种速度也大大加快；能定向改造植物的遗传性状，提高了育种的目的性与可操作性。至世界上第一株转基因烟草问世以来，基因工程技术的应用已经得到快速发展，目前已经有35科120多种植物转基因获得成功[4]。目前用于植物基因工程的转基因方法很多，如：基因枪法、电穿孔法、显微注射法、激光法、超声波、PEG法、脂质体法和农杆菌介导法以及花粉管通道法[5]等。本实验用农杆菌介导法，将IrrE转入甘蓝型油菜。通过PCR技术进行阳性苗的分子鉴定，荧光实时定量PCR检测其转录水平的表达，结果表明IrrE基因已经成功导入甘蓝型油菜并在其中进行mRNA水平的转录。

参考文献

[1] Earl A M,MohundroM M, Mian I S,et al..The IrrE p rote of Deinococcus radiodurans R1 is a novel regulator of recA expression[J].J.Bacteriol,2002,184:6216 - 6224.

[2] Hua Y,Narumi I,Gao G,et al..Pp rI:a general s witch responsible for extreme radioresistance of Deinococcus radiodurans [J].Bi ochem. mun.,2003,306:354-360.

[3] 潘婕.转抗辐射总体调控基因IrrE大肠杆菌的耐盐性及转录谱分析[D].中国农业科学研究院生物技术研究所博士论文.

[4] 张乃国,杨贵华,李春梅,等.脱毒甘薯、马铃薯的繁育及高产栽培技术[J].中国农村科技,2006(8):10-11.

[5] 王关琳.植物基因工程[M].北京:中国科学出版社, 2002.