黄芩苷―壳寡糖复合物的制备及其表征
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[摘要] 该文将壳寡糖应用于黄芩苷复合物的制备，以提高药物的体外溶出度，考察复合物的基本性质。采用溶剂法制备黄芩苷壳寡糖复合物，运用差示扫描量热法（DSC）、扫描电镜法（SEM）、X-射线粉末衍射法（XRD） 和红外振动光谱（IR）等分析方法对其结构和理化性质进行了分析，并考察其溶出行为。实验结果显示黄芩苷-壳寡糖摩尔比1∶1制备的复合物能显著提高黄芩苷的溶出度。DSC和XRD分析结果显示黄芩苷以非晶形态存在，IR结果表明壳寡糖与黄芩苷之间存在相互作用。黄芩苷-壳寡糖复合物能够显著提高药物的体外溶出度。
[关键词] 黄芩苷；壳寡糖；复合物
黄芩苷是中药黄芩中提取的一种黄酮类化合物[1]，具有清热解毒、抗炎[2]、利胆、降压、利尿、抗变态反应、抗焦虑[3]等多方面的药理作用，临床上在抗氧化、抗肿瘤、抗HIV以及治疗心血管疾病等方面具有显著疗效[4]。然而黄芩苷水溶性、脂溶性均较差，造成口服制剂体内吸收差、生物利用度低，从而限制了其临床应用[5]。为改善黄芩苷的溶出度，固体分散体技术有较多的研究报道，但是载体用量一般较大[6-8]。
壳寡糖是壳聚糖降解而获得的2～10个氨基葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成的低聚糖，也叫几丁寡糖，学名为β-1，4-寡糖-葡萄糖胺[9-10]。壳寡糖是壳聚糖系列的低相对分子质量产品，具有水溶性好、生物活性高、功能作用大、易被人体吸收等突出特点，在医药、食品、农业等领域应用广泛[11]。王星[12]通过硬脂酸与壳聚糖之间的盐键结合制备了硬脂酸壳聚糖复合物。本文尝试将含有氨基的壳寡糖与含有羧基的黄芩苷通过相互作用形成复合物，以期待改善黄芩苷的溶出度，并考察复合物的物相特征。
1 材料
黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110715-200514） ；黄芩苷（南京泽郎医药科技有限公司，批号ZL20121015A，纯度>98%）；壳寡糖（重均相对分子质量1 000左右，浙江金壳药业有限公司，批号D130304018）；数显气浴恒温振荡器（金坛市双捷实验仪器厂）；DSC204-差示扫描量热仪（德国Netzsch公司）；6390LV-扫描电镜（日本电子公司）；D8型X-射线衍射仪（德国Bruker公司）；470-傅立叶红外光谱仪（美国Nicolet公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪；甲醇、甲酸为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 样品的制备
2.1.1 黄芩苷-壳寡糖复合物的制备 称取黄芩苷原料药适量，加适量95%乙醇溶解。按药物与载体摩尔量比3∶1，2∶1，1∶1分别称取壳寡糖，溶解于适量95%乙醇。药物与载体的乙醇溶液充分混匀，在45 ℃减压下旋转蒸发除去溶剂，真空干燥，研细过80目筛，即得黄芩苷-壳寡糖复合物，置干燥器内保存备用。
2.1.2 物理混合物的制备 按摩尔量比例1∶1称取黄芩苷原料药和壳寡糖，混合均匀，制得物理混合物，备用。
2.2 方法学考察
2.2.1 色谱条件 Luna C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm ）；柱温30 ℃；流动相甲醇-0.1%甲酸水（52∶48）；流速1 mL・ min-1；检测波长280 nm；进样量10 μL。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品6.34 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得253.60 mg・L-1黄芩苷对照品储备液。
2.2.3 线性关系考察 分别精密吸取黄芩苷对照品储备液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL各置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，分别量取10 μL注入HPLC仪，测定峰面积（A），将质量浓度（C）与A进行线性回归，得标准曲线方程A=25.527C+13.835，r=0.999 7；线性范围2.536～126.80 mg・L-1。
2.2.4 精密度试验 取同一浓度黄芩苷对照品溶液，连续进样5次，测得黄芩苷峰面积的RSD 1.3%，精密度良好。
2.2.5 稳定性试验 取黄芩苷对照品溶液，于配制后0，2，4，8，12 h进样，黄芩苷的峰面积没有明显变化，RSD 0.90%，表明黄芩苷溶液在室温下12 h内稳定。
2.2.6 加样回收率试验 取6份已知黄芩苷含量的复合物，精密称定，分别置50 mL 量瓶中，分别精密加入黄芩苷对照品溶液适量，甲醇稀释至刻度，按上述色谱条件测定含量，计算回收率，黄芩苷平均回收率分别为100.2%，RSD 1.8%。
2.3 溶解度
分别取过量的黄芩苷和黄芩苷-壳寡糖复合物各3份置于10 mL具塞刻度试管中，加蒸馏水10 mL，置于37 ℃ 恒温振荡器中避光振摇24 h，达到平衡后取出，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，按2.2.1项测定黄芩苷含量。黄芩苷原料药的溶解度仅为0.095 3 g・L-1，复合辅料中的黄芩苷溶解度为0.836 0 g・L-1，制备成复合物使原料药的溶解度提高了约8.77倍。
2.4 体外溶出试验
精密称取黄芩苷及其复合物分别装胶囊，按溶出度测定方法（《中国药典》2010年版二部附录XC桨法），分别以pH 4.5醋酸盐缓冲溶液、pH 6.8磷酸盐缓冲溶液及水相为溶出介质[13-15]，转速50 r ・ min-1，温度（37±0.5） ℃，分别于5，10，20，30，45，60，90，120，180，240 min 取样5 mL（同时补加同温度等量溶出介质），以0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液10 μL进行HPLC测定，测定结果代入标准曲线计算浓度，并换算成累积溶出率，结果见图1～3。
结果显示，在pH 4.5醋酸盐缓冲溶液、pH 6.8磷酸盐缓冲溶液、水3种溶出介质中，壳寡糖与黄芩苷制备的复合物可明显提高黄芩苷的溶出度。随着壳寡糖用量的增加，黄芩苷溶出度增大；且随着溶出介质pH增加，黄芩苷溶出度增大，在水相中，黄芩苷与壳寡糖摩尔比为1∶1时，黄芩苷在45 min内的溶出度为80%左右，其溶出性能较黄芩苷样品提高约2.0倍。
2.5 复合物物相表征
2.5.1 差示扫描量热法（DSC） 测试条件为铝坩埚；气氛氮气；升温速率10.00 ℃・ min-1 ；升温范围0～400 ℃。分别对黄芩苷、壳寡糖、黄芩苷与壳寡糖物理混合物及其复合物进行DSC分析，结果见图4。
结果显示，黄芩苷在222.44 ℃处出现一个明显吸热峰；壳寡糖在204.45 ℃处有明显的放热峰，在210.05 ℃处出现一个明显吸热峰；物理混合物中存在黄芩苷、壳寡糖的放热峰和吸热峰，说明二者仅为简单的物理混合；复合物中原料药的特征峰消失，说明复合物中黄芩苷可能以非晶体形式存在。
2.5.2 电子扫描显微镜（SEM） 测试条件为真空镀金70 s，用扫描电镜观察黄芩苷、壳寡糖、黄芩苷与壳寡糖物理混合物及其复合物的表面和晶体结构，结果见图5。
结果显示，黄芩苷为结晶体；壳寡糖为类球形颗粒；物理混合物可以观察到黄芩苷结晶体和壳寡糖类球形颗粒；而在复合物电镜图谱中黄芩苷和壳寡糖的形态特征均消失，呈现出大小不一、不规则的块状。
2.5.3 X-射线粉末衍射法分析（XRD） 测试条件为Cu靶（40 kV，40 mV）；步进扫描0.01 °/步；扫描范围5°～70°；扫描速度4°・min-1，结果见图6。
结果显示，黄芩苷在5°～48°有多个强的结晶特征衍射峰；壳寡糖为非结晶化合物，没有明显的衍射峰；物理混合物的谱线中黄芩苷结晶衍射峰存在，说明简单的物理混合未改变药物的结晶形式；而在复合物的谱线中，黄芩苷特征峰几乎消失，说明黄芩苷可能以非晶体形态存在。
2.5.4 傅利叶变换红外光谱（FTIR） 采用KBr压片法测定红外光谱，将样品与KBr在干燥环境下混合制片后，分辨率4 cm-1，4 000～500 cm-1全谱扫描，结果见图7。
结果显示，黄芩苷与壳寡糖的混合物图谱基本上是黄芩苷与壳寡糖主要峰的叠加，而黄芩苷壳寡糖复合物图谱同样具有黄芩苷与壳寡糖红外光谱的特征，与混合物的红外光谱基图形走势大体一致，但复合物红外光谱的某些特征峰在波数与峰形上与混合物的具有明显差异。复合物中黄芩苷在3 300～3 600 cm-1的羟基伸缩振动峰及1 726.47，1 756.35 cm-1处的-COOH中羰基特征吸收峰消失，1 663.73 cm-1处强峰（分子中羰基特征吸收峰） 减弱，同时，黄芩苷苯环的骨架振动峰也发生变化，其中1 609.96 cm-1向高波数移动至1 615.93 cm-1，中强峰1 574.10 cm-1消失，在1 589.06 cm-1处出现较弱的新峰；壳寡糖在1 630.86，1 520.33，1 311.02 cm-1处酰胺Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的特征吸收峰[15-16]消失或减弱，这些可能是由于黄芩苷的羧基和壳寡糖的氨基存在相互作用而导致的。
3 讨论
壳聚糖是自然界中大量存在的高分子碱性氨基多糖，具有来源广泛、价格低廉、性质稳定、无毒、良好的生物相容性和生物可降解性已被广泛应用于医药食品化工生物工程等领域[16]，由于相对分子质量的关系，壳聚糖不易溶解在中性的水溶液中，这在一定程度限制了其应用。壳寡糖是壳聚糖的降解产物，具有相对分子质量小、水溶性好、生物活性强、功效更优越等特点[11]。
本实验通过壳寡糖分子的氨基和黄芩苷羧基的相互作用，成功制备了壳寡糖-黄芩苷复合物，显著增加了黄芩苷的溶出度。分析原因，一方面可能与有形成复合物后黄芩苷以非晶形态的存在状态有关，由于晶体结构的消失，黄芩苷分子无需克服晶格能的作用而增加溶出度。另一方面可能是由于复合物增加了黄芩苷溶解度。
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Preparation of baicalin-chitooligosaccharide compound and its characterization
JIANG Yan-rong1，2，ZHANG Zhen-hai1，YE Yu-miao3，YAN Hong-mei1，DING Dong-mei1，JIA Xiao-bin1，2*
（1.Key Laboratory of New Drug Delivery System of Traditional Chinese Medicine under State Administration of
Traditional Chinese Medicine，Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine，Nanjing 210028，China；
2. Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China；
3. China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）
[Abstract] To apply chitooligosaccharide in the preparation of baicalin compound，in order to increase the drug dissolution in vitro，and investigate the basic property of the compound. Baicalin-chitooligosaccharide compound was prepared by using the solvent method. The structure and physicochemical properties of compound were analyzed by using differential scanning calorimetry （DSC），scanning electron microscopy （SEM），X-ray powder diffraction （XRD） and infrared vibrational spectrum （IR），and its dissolution behavior was also investigated. The results showed that the compound prepared at baicalin-chitooligosaccharide molar ratio of 1∶1 could significantly improve the dissolution of baicalin. The results of DSC and XRD analysis suggested that baicalin may exist in an amorphous state. IR results indicated the interaction between baicalin and chitooligosaccharide. The baicalin-chitooligosaccharide compound could significantly improve dissolution in vitro of drug.
[Key words] baicalin；chitooligosaccharide；compound
doi：10.4268/cjcmm20140419