骨髓间充质干细胞的研究进展
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[摘要] 骨髓间充质干细胞（BMSCs）是骨髓基质中存在的非造血系的成体干细胞，具有多向分化潜能，已成为国内外基础医学和临床医学研究的热点。本文简要介绍了BMSCs的概念提出、生物学特性、培养、鉴定，并根据近年来国内外包括应用中药进行的诱导分化、组织工程、基因治疗、再生医学等相关研究及临床应用前景作一综述。
[关键词] 骨髓间充质干细胞；诱导分化；组织工程；中药
[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（c）-0025-03
早在1867年，世界著名病理学家Cohneim发现了骨髓中非造血系的干细胞，发现这类干细胞能够产生愈合伤口的成纤维细胞，后来Caplan[1]称之为间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），因为这类细胞除骨髓外，还广泛分布于脂肪、外周血、脐血、羊水、胎盘、胎肺、胎肾、牙髓、肌腱、滑膜、骨骼肌等不同的组织中，可定向分化为造血细胞以外的神经胶质细胞、肌细胞、腱细胞、成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、平滑肌细胞等多种细胞，支持造血，对造血干细胞有扩增作用，具有贴壁生长、高度可塑、免疫调节的性质，在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入和表达[1-2]。本文在此基础上对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的研究及其应用作一综述，以期开拓新的研究领域和临床应用。
1 改良性的BMSCs分离培养和鉴定方面的研究
体外培养的小鼠及人的BMSCs形态学特征主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。BMSCs的体外分离方法有四类：贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞术和免疫磁珠分离法。贴壁培养法更换培养液去除造血系细胞后还残留有单核细胞、淋巴细胞贴壁生长，需要严格控制胰蛋白酶的剂量和消化时间，连续培养才能清除并得到相对的纯化[3]。其余方法虽然可以获得纯度较高的BMSCs，但易破坏其活性。因此培养鉴定方法的改良引起了研究者的兴趣，以期探索获得高纯度BMSCs的简单、系统的实验方法。
目前尚未发现公认的BMSCs特异性表面抗原。BMSCs表达CD34、CD106、CD124、CD105、CD146、CD90、CD13、CD44、CD54、CD29、CD73、CD120a、CD166等，不表达造血细胞的标志CD10、CD11b、CD14、CD31、CD34、CD45、CD49、CD106[4-6]，其中有关CD34、CD106的报道不一致。通常还是通过形态和培养特性结合免疫方法进行BMSCs鉴定。
2 BMSCs免疫研究
BMSCs抑制T细胞增殖导致免疫耐受[7]。把BMSCs与T细胞共同培养，T细胞不增殖，且可以对其他异物进行反应，随着干细胞的分化，其抗原性并未随之增加，说明BMSCs移植潜力很大。Miyake等[3]认为BMSCs能够体外抑制T细胞功能，指出BMSCs可以作为免疫调节剂，控制移植物抗宿主病的发生，以BMSCs注射受体小鼠骨髓腔，再注射供体细胞，能够预防移植物抗宿主病。
3 诱导分化与相应的组织修复研究
干细胞在不同的情况下表现出不同的分化方向。BMSCs经诱导后可定向分化为树突状细胞、多巴胺能神经元、关节盘细胞、心肌细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、成骨细胞、星形胶质细胞、血管内皮细胞[7-10]，因而可望进行相应的组织修复，比如免疫功能的修复、分泌多巴胺的神经细胞的数量增加、关节盘的修复、损伤的心肌的修复、骨骼肌的修复、软骨和骨骼的修复、血管的修复等。BMSCs的体外分化是组织工程的良好方法。
4 BMSCs标记的改良研究
采用BrdU标记BMSCs，联合BrdU单克隆抗体进行免疫组化染色，48 h后细胞标记率>90%，且不影响细胞的形态、生长、增殖及分化。Zhang等[11]认为BrdU标记是对移植的BMSCs迁移、增值、分化等行为进行动态观察的切实可行的方法，而且具有无放射性污染、节约时间、操作方便迅速、标记效率高、准确性高等优点。
5 不同方向的动物实验及临床应用研究
BMSCs可被定向诱导分化为临床所需的多种组织细胞，因其取材方便、易于体外培养、扩增迅速、较弱的免疫原性，能较好地抑制混合淋巴细胞反应，不存在组织配型和免疫排斥等方面的问题，符合伦理道德原则，被称为组织工程及再生医学中理想的种子细胞[2，4]，可用于不同方向或目的的动物实验及临床应用研究。Zuo等[12]将关节软骨细胞与BMSCs共同培养，发现它们之间存在着相互作用，BMSCs对加强关节软骨基质的形成起着刺激和支持作用，直接接触的效果比可溶性因子的作用更大。Boonyagul等[13]应用不同浓度的乙酰化甘露聚糖处理大鼠BMSCs的体外实验结果显示，乙酰化甘露聚糖显著增加BMSCs的增殖，血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白-2、骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达，碱性磷酸酶的活性与骨质沉积。在体实验结果显示，乙酰化甘露聚糖治疗组与未处理的对照组相比有较高的骨密度，骨愈合快，治疗组骨小梁大量生长，表明乙酰化甘露聚糖可通过刺激BMSCs进行增殖，诱导骨形成的生物活性分子，使BMSCs分化为成骨细胞，合成细胞外基质。Xin等[14]将BMSCs与无细胞生物材料支架结合成功地重建了组织工程心脏瓣膜，表明种子细胞与生物支架整合的可行性，且促进血液中BMSCs的增值和分化。Matsumoto等[15]应用电刺激诱导BMSCs分化成神经细胞，然后移植给脑损伤模型小鼠，发现电刺激的BMSCs细胞顺利分化成神经细胞，而不是分化成星形胶质细胞，促进了脑损伤的恢复，且发现电刺激的BMSCs细胞表达神经元素2增加，通过β-catenin通路抑制BMSCs向星形胶质细胞的分化，促进其向神经细胞的分化，表明BMSCs治疗脑损伤的前景广阔。
6 中医药结合BMSCs的研究
中药可以通过调节微环境的生长因子水平，促进微循环血供，形成一个有利于移植细胞存活的微环境，促进干细胞的定向分化，进而应用于临床治疗。高志超等[16]应用补骨脂素诱导BMSCs，结果表明，BMSCs复合载异补骨脂素支架材料具有显著的骨诱导作用，可应用于临床修复骨缺损。范东艳等[17]将红景天苷与BMSCs联合应用治疗帕金森病大鼠，发现治疗后大鼠行为异常程度较轻，脑组织内酪氨酸羟化酶mRNA表达水平较高，表明联合用药优于单独应用中药或BMSCs。程小丽等[18]应用补肾益髓中药血清孵育BMSCs进行移植，显著提高了缺血脑组织中生长因子和神经营养因子的水平，较快地恢复了大脑功能；该研究团队还应用地黄饮子孵育BMSCs进行移植，能够显著提高大鼠缺血损伤脑组织的Bcl-2水平，降低Bax的水平，对缺血性脑损伤具有保护作用。
7 结语
BMSCs方面的研究进展很快，前进中也遇到了如下一些问题：①到目前为止，人们对BMSCs的认识仍停留在培养细胞的特征上，BMSCs的定义仍然是根据体外培养的细胞自我更新和分化的潜能而提出的“权宜性”的概念；人们对活体内干细胞的形态特征、发育起源、解剖定位以及在器官生成和出生后组织稳态中所起的作用还知之甚少；目前尚缺乏作为干细胞所应具有的非对称分裂特征的证据，未发现BMSCs特异性的表面标志物，难以直接鉴定，还是根据形态等非特异性表面标志物来判断，BMSCs的“干细胞性”还需要大量的实验来进一步证明。②由于干细胞的特性、分离方法的限制及BMSCs培养过程中的异质性，几乎不可能得到绝对纯化的BMSCs，分离方法的改良研究很多，仍需进一步深化。③由于实验方法、实验条件的不同，来自不同实验室的报道不尽一致，甚至有不少矛盾的地方，BMSCs在不同条件下可以治疗肿瘤，也可以导致肿瘤的发生和发展，还需要大量研究来界定条件，排除矛盾。尽管对BMSCs的特性还缺乏认识，从研究到应用还有个过程，考虑到从1970年起，人们对BMSCs的研究才40余年就取得了丰硕的成果，形成了如下共识，BMSCs具有多向分化潜能和易于体外扩增，取材容易，易于基因操作，组织相容性好，是组织工程、基因工程、组织再生修复的理想种子细胞，可望广泛用于脑缺血、心肌缺血等导致的组织损伤的修复、骨和软骨组织的修复、1型糖尿病患者胰岛细胞的分化、血液病和肿瘤疾病的治疗、基因治疗，中医药的引入拓宽了BMSCs研究的新领域，临床应用前景广阔。
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（收稿日期：2013-01-24 本文编辑：郭静娟）