荔枝中提取多糖的工艺研究

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【摘 要】 目的：以荔枝干肉为原料，采用热水浸提技术从荔枝干肉中提取水溶性多糖。方法：首先进行单因素实验，然后通过正交实验试验分析方法优化热水浸提荔枝干肉得到水溶性多糖的最佳工艺参数，最后对多糖含量进行测定 结果：热水浸提提取的最佳工艺参数为荔枝干肉与水溶剂最佳比例1：17（g/ml）、提取温度100℃、提取时间4.0h、醇沉时加入3倍体积乙醇，醇沉时间为5h。

【关键词】 荔枝干 多糖 水提醇沉 提取工艺参数优化 正交试验

1 引言

荔枝（litchi）是无患子科荔枝属植物，原产自中国，至今有2000多年的栽培历史。荔枝果皮色泽鲜红，肉质则洁白而晶莹，汁多而味甜，营养非常丰富，深受人们的喜爱。《本草纲目》述称：常食荔枝能补脑健身，能治疗瘰病疗肿，开胃益脾补养元气，是产妇和老弱者的良好补品[1-2]。荔枝的成分：可食用部分73%。每100g中含能量293KJ、水分81.9g、蛋白质0.9g、脂肪0.2g、膳食纤维0.5g、碳水化合物 16.lg、胡萝卜素10μg、视黄醇当量2μg、硫胺素0.1mg、核黄素 0.04mg、尼克酸1.1mg、维生素C41mg，钾151mg、钠1.7mg、钙2mg，镁12mg、铁0.4mg，锰0.09mg、锌0.17mg、铜0.16mg、磷24mg、硒0.1等[3]。荔枝果肉中含有大量的糖、维生素c，磷、钙，以及少量蛋白质、脂肪、铁、维生素B等人体必需的营养物质，味道甜美可口，是难得的滋补佳品。研究显示，荔枝多糖在抗活性氧、抗衰方面具有较强的作用[4]。果皮中还存在着一些具有很强抗氧化作用的酚酸、黄酮类物质，这些物质可用于制药或制保健食品的功能性辅料[5]。荔枝核种子中含有1.12%的皂甙，3.43%的蒜质，9.74%的还原糖淀粉及12.5%的总糖，此外还有脂肪酸仁，氨基酸仁及聚合花色素成分[6]。不同品种的荔枝果肉中多糖含量有一定差异，多糖含量由高到低依次是：桂味>黑叶>妃子笑>糯米糠>槐枝>白蜡[7]。荔枝果实的糖/酸比较高，存在品种差异，妃子笑为65.7，糯米糍高达92.3[8]。

多糖又称多聚糖（Polysaccharide），它是由10个以上单糖通过糖苷键连接成的聚糖，分子量一般为数万甚至达数百万。多糖作为构成生命的四大基本物质之一，它来自于高等植物、动物细胞膜以及微生物细胞壁中的天然高分子化合物[9]。现在国际上多糖研究以日本、美国、德国和加拿大处于领先地位，我国多糖的研究虽然起步较晚，自80年代以后各地纷纷掀起研究热潮。药理和临床研究证明，某些多糖具有增强免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗氧化、抗衰老、降血脂等多种生理活性[10-12]。

对多糖提取研究正日益引起人们的关注，因此在荔枝中提取多糖的工艺研究有了重要的意义。本实验采用水提醇沉法提取荔枝多糖。目前，这也是在植物活性多糖提取中应用最多的方法。多糖常与其它分子共存于植物中，可利用多糖不溶于有机溶剂的性质在提取液中加入乙醇等使多糖从提取液中沉淀出来，达到初步分离纯化的目的。本文研究了对荔枝多糖提取工艺。选用廉价且无毒副作用的水作溶剂，对荔枝多糖提取条件进行优化，从而以最大限度提高荔枝多糖的提取率，从而为荔枝多糖产品的规模化生产与应用奠定理论和实验基础，也为开发高档次、附加值高的各种食品和营养保健品提供参考。

2 材料与方法

2.1 试剂及仪器

荔枝干（糯米糍）当地市场购买；葡萄糖（分析纯）；苯酚（分析纯）；浓硫酸（分析纯）；无水乙醇（分析纯）；氯仿（分析纯）；正丁醇（分析纯）；丙酮（分析纯）；木瓜蛋白酶（酶活力≥6000U/mg）；透析袋：截留分子量14000；T200型电子天平；数显电子恒温水浴锅；KA-1000型离心机；721可见分光光度计；CS101-1C电热鼓风干燥箱。

2.2 实验方法

2.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制[13-14]

采用分光光度法测定荔枝多糖的浓度，其原理是：多糖类成分在浓硫酸作用下，先水解成单糖，然后迅速脱水成糖醛衍生物，最后与苯酚缩合成有色化合物，该产物在490nm处有强吸收峰。

精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品20mg，置于500mL容量瓶中，加入蒸馏水稀释至刻度，配成0.04mg/mL的标准溶液。然后精密移取标准溶液0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL，1.2mL， 1.4mL，1.6mL，1.8mL，置于具塞试管中，各以蒸馏水补充至 2.0mL，然后加入6%苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，静止l0min，摇匀，室温放置20min后于490nm测吸光度，以2.0mL水按同样显色操作作为空白，以吸光度（A）对葡萄糖浓度（C）做回归处理，得回归方程：y=0.0539x-0.0224 R2=0.9994

2.2.2 荔枝多糖含量的计算[15，16]

荔枝多糖的计算多糖产率（%）=粗多糖质量/原料质量×100%

多糖含量测定采用苯酚-硫酸法。样品溶液的制备：精密称取经过处理的荔枝多糖10mg，置于250mL的容量瓶中，蒸馏水定容浓度为，放入冰箱中备用。荔枝多糖得率测定：吸取样品溶液1.0mL（3份），分别置于20mL的试管中，加1mL水，1mL6%苯酚，5mL硫酸，共计体积8mL。测其吸光度，根据回归方程计算多糖含量。

多糖含量（%）=C*D*F/m×100%

其中C为多糖中葡萄糖浓度，D为稀释因子，F为多糖换算因子（经实验测定糯米糍荔枝多糖F值为2.116），m为粗多糖质量。

2.2.3 荔枝肉水溶性多糖的提取流程

原料处理热水浸提趁热离心去渣浓缩脱蛋白离心醇沉洗涤干燥透析干燥分析测定。

操作工艺要点：

（1）原料处理：荔枝干去掉壳和核，称取一定量（5g）的荔枝干肉，使用60℃热水浸提20min，待荔枝干肉吸水膨胀后静置冷却至室温，使用搅拌机捣碎成浆。

（2）热水浸提：首先将搅碎的样品液在电炉上慢慢加热至所需温度，然后将其放进恒温水浴锅中进行恒温浸提所需时间。

（3）离心：趁热将浸提液用台式高速离心机进行离心25min，速度为4000r/min（实验室离心机最大转数），除去残渣得到澄清度较高的浸提液，以提高多糖提取率。

（4）浓缩：将离心过滤后的浸提液放进65℃的水浴锅中进行蒸发浓缩，直至体积浓缩为原来的1/5。

（5）除蛋白：酶法―Savage联合法 荔枝多糖溶液中加入1%的木瓜蛋白酶（g/ml），在pH6.4条件下，于60℃酶解3h后使用离心机 4000r/min离心25min，取上清液，再采用Savage法：荔枝多糖溶液中加入1/4体积的正丁醇―氯仿混合液（正丁醇氯仿=1：4），磁力搅拌器高速搅拌20min，4000r/min离心20min，取出上层多糖溶液，弃去下层有机相和蛋白沉淀，重复多次，直到无蛋白沉淀为止[15]。

（6）醇沉：将脱蛋白多糖溶液沿玻棒慢慢加入到无水乙醇溶液中，将多糖沉淀液静置于冰箱冷藏室调至4℃。

（7）抽滤：将已经醇沉过的多糖液经抽滤装置进行抽滤，收集滤渣。

（8）透析：将滤渣溶解于适量蒸馏水后灌入透析袋中，夹紧透析袋，置于一大烧杯中，加入蒸馏水至完全浸没透析袋，每8h换1次水，重复3次。本验所用的透析袋是截留分子量为14000的透析袋。

（9）洗涤干燥：将已经过透析的多糖溶液依次用无水乙醇、丙酮、乙醚清洗，重复2次。洗涤后多糖在30℃烘箱内进行干燥即得多糖[1]。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验

3.1.1 水溶剂浸提料液比的选择

称取经过预处理的荔枝干肉5.0g，热水溶胀处理，打浆，分别以料液比1：8、1：11、1：14、1：17、1：20（g/ml），在70℃的条件下浸提3h根据多糖的提取率确定水溶剂浸提最佳料液比。实验结果如图2所示。

由图2可以看出，当料-液比小于1：17时，随着料液增大，荔枝粗多糖的提取率也随之提高；但料-液比超过1：17后，粗多糖提取率增加不明显，因此，料-液比选择为1：15，1：17，1：19，1：21为佳。

3.1.2 水溶剂浸提时间的选择实验

准确称取经过预处理的荔枝干肉5.0g，打浆，提取的料液比由上一实验确定（1：17），加热分别浸提2，3，4，5，6h，温度为70℃多糖的提取率，确定水溶剂浸提最佳浸提时间。实验结果如图3所示。

由图3可以看出：当浸提时间小于4h时，随着浸提时间的增加，荔枝多糖的提取率也随之提高；当浸提时间大于4h后，随着浸提时间的增加，多糖的提取率反而缓慢下降。在4h后随着浸提时间的延长，提取率总体呈下降趋势，部分原因可能是由于浸提时间过长，降低了某些反应的活化能，使多糖分子之间、多糖分子与其他分子之间形成新的作用力，增加分子之间碰撞机会，阻止多糖分子溶出；也可能是山于蛋白变性沉淀后包裹在果肉颗粒表面，导致多糖浸出率下降[17]。因此，浸提时间可以选为4、4.5、5、5.5、6h。

3.1.3 水溶剂加热浸提温度的选择实验

准确称取经预处理的荔枝干肉5.0g，称取5组，打浆，提取的料液比及时间由上一组确定，浸提温度分别为60、70、80、90、100℃确定最佳浸提温度。实验结果如图4所示。

由图4可以看出：当浸提温度小于80℃时，随着温度提高，荔枝多糖提取率会逐渐上升；当浸提温度大于80℃后，随着温度继续的升高，荔枝多糖提取率开始缓慢下降。因此，选择70℃，80℃，90℃，100℃为宜。

3.1.4 无水乙醇加入体积对多糖得率的影响

在所得的多糖溶液中分别准确加入1、2、3、4、5倍无水乙醇，确定加入无水乙醇的最佳体积。实验结果如图5所示。

由图5所示：随着无水乙醇加入体积的增加，在1到3倍内，多糖量明显增加，超过三倍后，随着无水乙醇体积的增加，荔枝多糖的提取率逐渐下降。所以选用3、3.5、4、4.5倍为宜。

3.1.5 醇沉时间对多糖得率的影响

醇沉过后，将多糖醇沉液放入冰箱冷藏中（4℃），分别静置3、4、5、6、7h，确定最佳醇沉时间。

由图6可以看出：在3到6小时内，随着醇沉时间的增加，多糖提取率明显上升，随后曲线坡度降低，提取率变化不大，所以选用4、5、6、7h为宜。

3.2 正交试验与结果分析

在上述单因素试验的基础上，采用四因素四水平作正交实验

表2可看出，7号实验结果最好，对应的优化组合为料液比1：17，温度100℃，时间为4h，以及3倍体积无水乙醇进行醇沉，沉淀时间5h，由极差R分析可知，多糖提取条件因素的主次顺序为醇沉体积>浸提温度>浸提时间>料液比>醇沉时间。

对正交试验结果再进行方差分析结果见表3，由表3可以看出：影响荔枝多糖提取率的主要因素是醇沉无水乙醇体积，然后是浸提温度和浸提时间，最后是浸提料液比和醇沉时间，主次顺序为：醇沉体积>浸提温度>浸提时间>料液比>浸提时间。

4 结语

本研究结果表明，影响荔枝多糖提取的主要因素是醇沉无水乙醇体积，其次是浸提温度与浸提时间，最后是料液比和醇沉时间，主次顺序为：醇沉体积>浸提温度>浸提时间>料液比>浸提时间。荔枝多糖提取的最优条件为：浸提时间4h，浸提温度100℃、料液比1： 17，醇沉时无水乙醇体积为多糖溶液3倍，醇沉时间为5小时，在这组工艺条件下，荔枝多糖的提取率最高。

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