白藜芦醇诱导白血病KG-1细胞凋亡及对其细胞周期的影响

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[摘要] 目的:探讨白藜芦醇诱导人白血病细胞株kg-1细胞凋亡的作用。方法:以不同浓度的白藜芦醇作用KG-1细胞,用噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长状态;透射电镜观察KG-1细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术(FMC)测定细胞凋亡率和细胞周期分布。结果:白藜芦醇可明显抑制KG-1细胞增殖(P

[关键词] 白藜芦醇;KG-1细胞;细胞凋亡

[中图分类号] R329.2+8[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)07(a)-021-02

The apoptosis effect of leukemia KG-1 cells induced by resveratrol and its effect on cell cycle

XU Hongjun

(Shijiazhuang Health School, Shijiazhuang 050200, China)

[Abstract] Objective: To investigate human leukemia KG-1 cells apoptosis induced by resveratrol. Methods: After treated with different concentrations RES,the suppressive effect of RES on proliferation of KG-1 cells was analyzed by MTT method.Transmission electron microscope technique were used to detect the apoptosis status of KG-1 cells.The cell cycle and apoptosis rate of KG-1 cells treated with RES were detected by flow cytometry. Results: RES could obviously inhibit proliferation of KG-1 cells (P

[Key words]Resveratrol; KG-1 cells; Apoptosis

白藜芦醇(RES)的化学名为3,4',5-三羟基-反-二苯代乙烯,分子式C14H12O3,分子质量为228.25,属于非黄酮类多酚化合物,广泛存在于种子植物中,并以新鲜葡萄皮中含量最高。RES对植物本身起保护作用,是植物在不利条件下产生的“植物补体”。随着研究的深入,人们发现RES对人类具有抗肿瘤特性和抗氧化、抗突变作用等 [1-5]。本实验研究白藜芦醇诱导人白血病KG-1细胞凋亡及对其细胞周期的影响,探讨白藜芦醇对白血病潜在的治疗作用。

1材料与方法

1.1细胞株培养及试剂

人急性白血病细胞株KG-1购自中科院上海细胞库,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,37℃,5% CO2条件下培养。白藜芦醇购自美国Sigma公司,用二甲基亚砜(DMSO)配制成0.2 mol/L母液备用。

1.2细胞增殖实验

采用MTT法。将细胞调整为1×105/ml,接种细胞于96孔板,每孔180 μl,24 h后,空白对照孔加含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基20 μl,实验组每孔分别加入20 μl不同浓度RES(终浓度依次为12.5、25、50、100、200 μmol/L),分别培养24、48、72 h,离培养终点4 h加入MTT(德国Serva公司)(5 g/L)20 μl,继续培养4 h后,离心弃上清,每孔加入DMSO 150 μl,酶标仪测定492 nm吸光度值,按下式计算对细胞的抑制率。抑制率(%)=(1-OD实验组/OD对照组)×100%。

1.3细胞周期检测

取对数生长期的KG-1细胞,调整细胞浓度为1×105/ml,加入培养瓶中,每瓶10 ml,培养24 h后离心换液,空白对照组加含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,实验组每瓶分别加入不同浓度RES(终浓度50、100 μmol/L),分别培养48 h后离心收集细胞,PBS洗涤,重悬细胞于70%乙醇,4℃固定过夜,经PBS洗涤,RNA酶37℃处理1 h,加入PI,室温反应10 min,用流式细胞仪(Epics-XLⅡ型)分析,应用Muticycle AV软件分析细胞周期分布及细胞凋亡率变化。

1.4细胞形态学观察

同上述方法处理细胞,24 h后,空白对照组加含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,实验组加入RES(终浓度100 μmol/L),继续培养48 h,离心收集细胞,冷PBS洗2次,4%戊二醛固定,2 000 r/min,离心10 min,加入琼脂糖搅匀,冷却后切块,1%四氧化锇固定,醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后,透射电镜观察细胞形态。

1.5统计学方法

实验数据用SPSS 13.0软件分析,结果以x±s表示,以α = 0.05为检验水准。

2结果

2.1白藜芦醇对KG-1细胞增殖的作用

白藜芦醇作用于KG-1细胞后,细胞增殖水平较空白对照组明显下降(P

Concentration(μmol/L)

Fig.1 Proliferation curve of KG-1 cell treated by RES

图1 白藜芦醇对KG-1细胞增殖抑制率影响

2.2白藜芦醇对KG-1细胞周期分布和细胞凋亡率的影响

白藜芦醇作用于KG-1细胞48 h后,随浓度的升高,S期细胞比率由41.4%上升至78.5%,凋亡细胞由(1.17±0.35)%增加至(18.21±2.1)% ,与对照组比较,差异均具有统计学意义(P

Tab.1 The effect of RES on the distribution

of KG-1 cell cycle(x±s)

Compared with control,*P

Fig.2 Effect of RES on apoptosis rate of KG-1 cell

图2 白藜芦醇对KG-1细胞凋亡率的影响

2.3白藜芦醇对KG-1细胞形态学的影响

经白藜芦醇作用后,KG-1细胞出现细胞核碎裂,部分核膜破损,胞质有大小不等的空泡,微绒毛数量减少,线粒体、粗面内质网等细胞器减少等细胞凋亡形态学改变;而对照组细胞核仁大而明显,稍微不整形。

3讨论

利用中药、天然药物及从中提取的有效成分制剂治疗白血病,已经日益受到广泛重视。白藜芦醇作为一种天然提取物,有很好的抗癌作用且无明显毒副作用,但其抗癌作用的机制还不十分清楚,1997年,美国的科研人员发现白藜芦醇具有抗肿瘤的功效,表现为对肿瘤的起始、促进和进展三个阶段均有抑制作用[6]。目前研究表明白藜芦醇对小鼠皮肤癌、肝癌、白血病等多种肿瘤有不同的增殖抑制作用[7-12]。本研究发现白藜芦醇在12.5 μmol/L浓度时就可以抑制KG-1细胞生长,这种抑制作用在一定浓度范围内(12.5～100 μmol/L)呈剂量依赖关系,随着浓度的增加,对KG-1细胞的增殖抑制作用增强,最大抑制率可以达到76.15%。

电镜观察结果显示KG-1细胞出现细胞核碎裂,部分核膜破损,胞质有大小不等的空泡,微绒毛数量减少,线粒体、粗面内质网等细胞器减少等凋亡细胞形态学改变,进一步说明白藜芦醇能抑制白血病KG-1细胞增殖,诱导细胞凋亡。

本实验采用FCM分析发现白藜芦醇可改变KG-1细胞周期的分布,与对照组相比,G0/G1、G2/M期细胞的比例均减低,S期细胞所占比例增高,这表明白藜芦醇可阻断KG-1细胞由S期向G2/M期的进程,由此可见白藜芦醇作为以细胞周期因子为靶点的生化调节剂使用。

综上所述,白藜芦醇可以抑制人白血病KG-1细胞的增殖,并能有效地诱导人白血病KG-1细胞凋亡,但是白藜芦醇诱导细胞凋亡的具体机制还需继续进行深入的研究与探讨。

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(收稿日期:2009-03-05)