利用SSR标记鉴定抗虫三系杂交棉邯杂301的纯度

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摘 要：三系杂交棉邯杂301在黄河和长江流域得到了大面积的推广，目前生产上仍然采用鉴定周期长，不能及时反映杂交种纯度，难以指导生产应用。本研究利用ssr分子标记技术，从196对引物中筛选到3对在双亲间表现稳定多态性的引物，可以快速准确的鉴定出该品种的杂交种纯度。与常规方法相比，准确率达到98%以上。

关键词：棉花； SSR；杂交种纯度

中图分类号：S562 文献标识码：A

由邯郸市农业科学院培养成功的国审棉邯杂301三系杂交棉在长江和黄河流域得到了大面积推广，杂种优势在生产上表现的十分明显，其不但产量高、品质好，且抗虫抗病能力强，深受棉农喜爱。在种子生产过程中，由于播种、收获和脱绒等诸多环节的存在，以及部分不良农户掺假使假，造成种子混杂，给棉花生产带来巨大损失；亲本选育世代长短一定程度上影响品种基因型纯合度，使杂交种植株间从表型或者基因型上产生差异。目前，SSR分子标记已经广泛应用小麦[1]、大麦[2]和棉花[3]等农作物杂交种纯度鉴定，为广大科研工作者所认可，是一种成本较小、程序简便、结果可靠的实用技术。

1 材料和方法

1.1 供试材料

三系杂交种邯杂301 种子及其亲本（恢复系父本和不育系母本）均由本课题组提供。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取

采用宋国立改良CTAB法提取DNA，DNA用TE溶液溶解，利用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000c检测后稀释到100ng/uL备用。

1.2.2 SSR及其产物检测

SSR引物根据潘兆娥[2/3]研究结果，参考http：//网站中提供的引物信息，从196对引物中筛选出分布于不同染色体上、带型清晰、在双亲间表现出稳定多态性的3对引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系为20uL，其中2x Tag Master Mix 10uL，Rnase Free Water 8uL，模板1uL，上下游引物各0.5uL（20uM）。PCR反应程序为94℃5min；94℃40s，51℃45s，72℃1min，35个循环；72℃10min，4℃保存。扩增产物在3.5%的琼脂糖凝胶上分离。凝胶电泳在DYY-12型电泳仪上进行，120V，电泳50min。用SYNGENE G：Box凝胶成像系统观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 亲本多态性引物筛选

利用196对SSR引物对邯杂301的亲本DNA进行扩增，绝大多数引物只能够扩增出1条带，个别引物扩增出两条带，扩增产物在100～500bp之间，从中筛选出在亲本间有稳定差异的多态性引物，部分引物的筛选结果如图1所示，箭头所指位置为产生差异的条带。其中3对引物在双亲间表现出多态性差异，编号分别为：Y27、Y55和Y105，其他引物在双亲间无显著多态性差异。

2.2 SSR引物检测杂交种纯度

SSR标记是一种共显性标记，呈孟德尔遗传，在双亲间表现出多态性差异的条带，在杂种F1中均能够得到扩增，呈现互补性。图2中的a、b和c分别是Y27、Y55和Y105对10粒混有母本的邯杂301杂交种及其亲本的扩增图

由图2a、2b和2c可以得知，Y27、Y55和Y105在亲本中出现了不同的多态性差异条带，在10株杂交种中均出现了“双亲互补型”条带，完全符合孟德尔遗传共显性标记的特征。样品中混杂的母本能够很容易检测出来。

3 讨论

种子混杂是由于人为的原因，在种子播种、收获、晾晒、轧花、脱绒和储存等诸多环节中形成的，经过严格管理，是人为可控的；若不育系败育不够彻底或品种间杂交种母本去雄不彻底或漏去雄，都有可能出现母本混杂的植株，在SSR检测时只出现母本条带的“偏母型”，对于其他类型的种子混杂，用该实验中筛选的引物同样可以鉴别。这对于育种家在棉花品种选育及推广过程中跟踪观察并保持品种纯度，具有一定的实际意义。

目前，单籽粒棉种DNA快速提取方法已见报道，结合本方法，可以在较短的时间内检测一批棉花杂交种的种子纯度，为棉花生产做出积极贡献。

参考文献

[1] 石海波，王立新，李宏，等.利用SSR标记区别小麦品种种子混杂SSR位点不纯的研究[J].分子植物育种，2006，4（4）：513-519.

[2] 陈志伟，李梁，陆瑞菊，等.一种利用SSR分子标记对大麦杂交种快速鉴定的方法[J].浙江农业学报，2010，22（ 6）： 736-740.

[3] 艾买提·图如普，申怀伟，梁亚军，等.棉花杂交种SSR标记检测技术的研究[J].新疆农业科学，2010，47（9）： 1733-1736.

[4]宋国立，崔荣霞，王坤波，等.改良CTAB法快速提取棉花DNA[J].棉花学报，1998，10（5）：272-275.

[5] 潘兆娥，孙君灵，王西文，等.基于棉花参比种质的SSR多态性核心引物筛选[J].生物多样性，2008，16（6）： 555–561.

作者简介：马维军（1964-），男，汉族，河北邯郸，任职于邯郸市农业科学院。研究方向：从事棉花三系应用研究。