运动对胰岛素抵抗模型大鼠骨骼肌GLUT4和PKBβmRNA表达的影响
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摘 要: 目的:观察运动对胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)模型大鼠胰岛素信号转导途径 中的关键蛋白GLUT4 (葡萄糖转运蛋4)和PKBβ(蛋白激酶Bβ)表达变化的影响。方法: 将健康Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、运动组及饮食干预组,每组8只。采 用高脂膳食喂养建立IR大鼠模型,分别以游泳运动和改饲普通饲料干预4周;测算胰岛素敏 感性指数(ISI);应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对各组大鼠骨骼肌细胞glut4和 pkbβ mrna表达进行观测和定量分析。结果:运动显著提高IR模型大鼠ISI(P
关键词:胰岛素抵抗;运动;GLUT4; PKBβ;胰岛素信号转导途径
中图分类号:G804.7
文献标识码:A
文章编 号:1007-3612(2010)06-0044-03
Mechanism study on Exercise’s effection on mRNA expression of G LUT4 and Akt2 in muscle cells of insulin resistance rats
BAI Zhenmin1,WANG Anli1,LI Shengzhi2
(1.Sport Rehabilitation Department, Beijing Sport University,
Beijing 100084, China;2.College of Preclinical Medicine, Heilongjiang
University of Chinese Medicine, Harbin 150040, Heilongjiang China)
Abstract: purpose: To develop a rat model of IR, and to study the effect of exer cise on expression of GLUT4 (glucose transporter 4) and PKBβ(protein kinase Bβ ) in somatic muscles of IR rats and the mechanism of acupuncture therapy in IR. Method: Male Wistar rats were randomly divided into 4 groups: The IR model rats without treatment group(M group), the IR rats with exercise group(E group), the IR rats with food intervention group(F group) and the normal control group(N gro up) and each group has 8 rats. Then the E group was treated with swimming exerci se and the F group was treated with common food for 4 weeks. 2. The blood sample s were collected to evaluate FINS, FBG and TG to calculate ISI (insulin sensitiv ity index). 3. The GLUT4 and PKBβ mRNA of skeletal muscle was determined with R T-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction). Results: exercise incr eased the IR rats’ ISI significantly(P
Key words: insulin resistance(IR); exercise:GLUT4;PKBβ;insulin sign al transduction pathway
胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)可引起包括:高胰岛素血症、高血糖、高血 压、血脂紊乱、纤维蛋白溶解系统异常、血管内皮功能改变、动脉粥样硬化在内的一系列病 理生理变化[1]。运动对糖尿病、肥胖、心脑疾病等IR相关疾病的疗效早已得到 了国内外 同行的公认,运动能改善胰岛素抵抗,虽然其干预的确切机制是发生在胰岛素受体水平还是 受体后水平目前尚无定论,但目前运动干预胰岛素抵抗的机制研究主要体现在运动对胰岛素 受体水平及胰岛素受体后水平的影响[2]。目前,骨骼肌葡萄糖转运的胰岛素信号 通路己比较清楚,即主要包括由磷酸肌醇激酶-3激酶 (PI3-K)介导和丝裂原激活蛋白激酶( MAPK)介导的两种途径[3],分别调控细胞的葡萄糖代谢和细胞的分裂增值活动。 其中PI3-K是介导葡萄糖进入靶细胞的关键酶,其蛋白或其偶联受体发生点突变或其他变异 ,将严重干扰胰岛素在细胞内信号的传导,是发生IR病的重要分子病理学基础[4] 。本研究通过高脂喂养产生IR大鼠模型,以反映IR水平的血液生化学指标以及与骨骼肌糖代 谢信号转导途径中的关键蛋白GLUT4(葡萄糖转运蛋4)和PKBβ(蛋白激酶Bβ)为对象,探讨 运动干预在IR模型大鼠胰岛素信号转导途径中GLUT4在PI3-K/PKB信号转导通路中转位的作用 ,既是探讨运动干预IR模型大鼠GLUT4 mRNA表达的机制,也是对运动干预IR机理的进一步研 究。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组
动物分组
选用健康Wistar雄性大鼠32只,体重200～220 g。大鼠适应性喂养一周,按体 重随机分为4组,每组8只。第1组为正常对照组,另外3组先制备成IR模型,分别为模型组、 运动组及饮食干预组。
1.2 实验动物模型制备及运动方法 参照都健等人的方法[ 5],大鼠适应性喂养一周,大鼠均自由取食、饮水,房间温度、 湿度保持恒定,观察其一般情况。实验组高脂膳食配方:脂肪热比为59%(其中猪油占39% ),蛋白质热比为21%(其中酪蛋白占31%),碳水化合物热比为20%(其中玉米淀粉占30 %),此外附加必需维生素及矿物质。正常对照组喂饲普通饲料。在造模4周后运动组大鼠 给予运动干预,期间模型组和运动组大鼠继续给予高脂膳食喂养4周,而饮食干预组与正常 对照组喂饲普通饲料。
运动方法:有氧运动干预方法按Ploug等报道的游泳训练方法进行适当改进,运动组大 鼠在高脂喂养4周出现胰岛素抵抗后,进行游泳训练,每周训练5 d,前2周每天训练40 min , 以后每天训练60 min,保持水温35℃左右,水深50 cm,每只大鼠的活动面积200 cm2,进 行为期4周的游泳训练。
1.3 胰岛素敏感性指数检测
在运动组大鼠给予运动治疗4周后,各组大鼠均禁食12 h过夜,次日空腹眼眶静脉窦采血 检测甘油三酯(TG)、空腹血糖(FBG)和血浆胰岛素(FINS)。FBG、TG测定用全自动生化 分析仪:FINS测定用放射免疫分析方法。胰岛素敏感性指数(ISI)参照李光伟等方法,以1 /(FBG×FINS)计算,因其为偏态分布,故取自然对数,即ISI=ln[1/(FBG×FINS)]。
1.4 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术 将上述各组大鼠采血 后脱颈椎处死,迅速分离双侧后肢骨骼肌,放入小玻璃瓶中,送至-70℃冰箱中保存备用于 RT-PCR实验。首先取组织样本100 mg,应用mRNA Enrichment kit(OMEGA),根据其附带说 明操作依次提取总RNA和mRNA。然后进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR):Glut4(Product :329nt)上游引物:5‘-CAC TGG TCC TTG CTG TAT TC-3’20nt,下游引物:5‘-CTG ATG
TTA GCC CTG AGT G-3’19nt;PKBβ(Product:167nt)上游引物:5‘-ATG GTA GCC AAC
AGT CTG AAG C-3’22nt,下游引物:5‘-TTG CCG AGG AGT TTG AGA TAA T-3’22nt。于P CR反应管内加入:反应总体积为25 μL,其中2.5Mm dNTP 3 μL(TOK ARA,Inc.),10×PCR Buffer 2.5 μL,上、下游引物各1 μL(10 pmol/μL),模板4
uL,1.25u rTaq酶(TOKARA,Inc.),于PCR仪(TaKaRa PCR Thermal Cycler)上进行扩 增 。反应参数:94℃ 5 min预变性;94℃ 45 s ,55℃ 45 s,72℃ 1 min,30个循环;72℃
延伸10 min。扩增产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 统计学处理
实验数据结果以均数±标准差(X±S)表示,本实验中的所有数据均采用SPSS
11.5统计软件进行统计分析,计量资料采用方单因素差分析法,进行组间均数比较的P检 验。P
2 结 果
2.1 胰岛素敏感性指数检测结果
检测结果显示实验中模型组FINS较正常组明显升高,而ISI却明显下降(P0.05)。模型组TG较正常组 明显升高(P0.05)( 表1)。
注:*与正常组比P
2.2 RT-PCR检测GLUT4、PKBβmRNA基因表达情况
本实验通过对各组大鼠骨骼肌细胞GLUT4 mRNA测定发现:造模各组GLUT4 mRNA含量均较 正常组明显降低(P
图1 Glut4 基因RT-PCR 扩增的凝胶电泳成像(Glut4 PCR 产物329nt)
M:DNAMarker(DL200)1:正常组 2: 模型组 3:饮食组 4: 运动组
另一方面本研究首次探讨运动与胰岛素PI3-K/ PKB途径信号通路蛋白PKBβ的关系。本 实验通过对各组大鼠骨骼肌细胞PKBβ mRNA测定发现:高脂喂养产生明显IR的大鼠模型组, 其骨骼肌中胰岛素诱导的PKBβ mRNA表达较正常对照组大鼠明显降低(P
图2 PKBβ 基因RT-PCR 扩增的凝胶电泳成像
(PKBβ PCR 产物167nt)
M:DNAMarker(DL200)
1:正常组 2: 模型组 3:饮食组 4: 运动组
3 讨 论
IR是代谢综合症、肥胖和糖尿病的主要病理生理变化,是胰岛素靶细胞及其相应受体 对胰岛素敏感性和反应性降低的一种病理状态,骨骼肌占全身葡萄糖利用的75%～80%,并且 是胰岛素受体后抵抗的主要部位,因而研究骨骼肌葡萄糖转运功能对于解释IR尤其重要 [6]。图3 大鼠骨骼肌GLUT4和PKBβmRNA表达
与正常组比P
近年来,骨骼肌葡萄糖转运的细胞信号转导机制研究十分活跃。己知至少有两类因素可 以通过影响葡萄糖转运蛋白来调节葡萄糖的转运,第一由胰岛素及类胰岛素物质诱发;第二 由肌肉收缩调节[7]。胰岛素受体后信号传导是IR研究的重要内容,在骨骼肌和脂 肪细胞, 胰岛素主要通过调控GLUT4易(或转)位促进葡萄糖转运,许多信号分子参与调控,其中某 些环节的缺陷可导致IR葡萄糖的跨膜转运是以骨骼肌为主的葡萄糖代谢的限速步骤,这一过 程是由细胞膜上的GLUT4介导并通过易化扩散来完成的。因此胰岛素敏感组织骨骼肌细 胞GLUT4mRNA含量的降低是胰岛素抵抗的重要标志,同时任何可以增加胰岛素敏感组织细胞 上GLUT4mRNA含量的措施都可能成为治疗胰岛素抵抗的重要途径[8]。
研究证明胰岛素抵抗发生机制与胰岛素信号传导通路PI3-K/PKB途径密切相关[9] 。体内外实验[10]证实在胰岛素抵抗及2型糖尿病时PKB蛋白水平明显受损,且存在 表达和活性改变的组织及亚型变化特异性。通过蛋白饮食干预性试验[11]及胰岛素 增敏剂药理学研究[12]表明减轻或逆转PKB受损状态,恢复其磷酸化水平及活性, 可使其下游GLUT4膜转位、糖原合成酶3(GSK-3)磷酸化等活动增加,提高葡萄糖摄取、糖 原合成,异常的糖代谢状态得以改善。因而PKB成为探索IR和相关疾病治疗途径中新的靶位 。
近年来,已有针对运动训练对骨骼肌胰岛素刺激的PI3-K活性的研究,表明运动训练引起了 骨骼肌胰岛素作用和胰岛素信号转导能力的提高。胡氏等[13]研究显示,8周的耐 力运动引起了胰岛素信号转导途径中关键信号蛋白PKB等的表达和活性增加,尤其是活性增 加较明显。Kemppainen的研究认为,运动训练可以通过提高PI3-K和PKB等的活性来增强胰岛 素信号传导,从而增加对葡萄糖的摄取[14]。Eduardo R等[15]采用4周龄 wistar大鼠经3个月高脂饮食诱导为肥胖模型后一次性游泳运动干预3 h(运动1.5 h后,中 间体息45 min),测试发现PI3-K和PKB的磷酸化水平明显升高。
本研究表明运动改善了胰岛素抵抗大鼠的胰岛素抵抗状况,使之趋向正常。检测结果提示IR 模型大鼠存在骨骼肌细胞GLUT4 mRNA含量降低的特征,运动可使骨骼肌细胞GLUT4基 因转录 增加,使GLUT4蛋白含量增加,使骨骼肌细胞转运和利用葡萄糖的能力增加。同时,高脂喂 养诱导的IR模型大鼠PKBβ mRNA的表达降低,削弱了胰岛素的降糖作用,这可能是IR产生的 原因之一,运动可使骨骼肌细胞PKBβ mRNA蛋白含量增加,促进了胰岛素PI3-K/PKB途径信 号通路中GLUT4的转位,其结果是骨骼肌细胞转运和利用葡萄糖的能力增加,运动改善了IR 模型大鼠的IR状况。本次实验中,运动及饮食干预的时间较短,是TG指标无明显好转的原因 ,同时相关指标通过4周的单纯饮食干预则没有显著性差异,考虑有可能是干预时间较短或 可通过结合运动叠加干预以期取得更明确疗效,仍需进一步研究。
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