CD4+CD25+调节性T细胞及其相关基因Foxp3在非小细胞肺癌患者外周血中的变化

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[摘要] 目的：探讨非小细胞肺癌患者外周血中cd4+cd25+调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）数量变化及其相关基因foxp3 mRNA的表达改变，探讨CD4+CD25+调节性T细胞在诱导肿瘤免疫耐受中的作用。方法：采用流式细胞术检测患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞数量变化；采用半定量RT-PCR方法检测肺癌患者外周血PBMC中Foxp3 mRNA的表达水平。选取30名非肿瘤患者作为对照。结果：肺癌患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞数量明显高于正常组（P

[关键词] CD4+CD25+；调节性T细胞；Foxp3；肺癌

[中图分类号] R734.2[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）03（a）-023-03

The changes of CD4+CD25+ T cells and expression of Foxp3 mRNA in peripheral blood mononuclear cells from patients with non-small-cell lung carcinoma

XU Lang, WANG Yu-bin, LIU Dan, LI Yu-hong, YAN Dan, SUN Yuan-chang, LIU Li-min

(Wuhan University of Science and Technology, Wuhan430065, China)

[Abstract] Objective: To investigate the changes of CD4+CD25+ T cells and expression of Foxp3 mRNA in peripheral blood mononuclear cells from patients with non-small-cell lung carcinoma. Methods: Flow cytometry was used to analyze the contents of CD4+CD25+ regulatory T cells in peripheral blood from the patients with non-small-cell lung carcinoma and patients without cancer as control. The expression of Foxp3 mRNA in peripheral blood mononuclear cells was detected by RT-PCR. Results: The population of CD4+CD25+ regulatory T cells in peripheral blood from the patients with non-small-cell lung carcinoma was significantly higher in comparison with that of control (P

[Key words] CD4+CD25+; Regulatory T cells; Foxp3; Lung carcinoma

肺癌是当今世界对人类健康危害最大的肿瘤之一，且其发病率有不断上升的趋势。预计到2025年，每年将有90万人死于肺癌，中国将成为肺癌第一大国。因此，对肺癌的研究意义重大。

CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）是健康个体T细胞库的组成部分，占CD4+细胞的5%~10%。该细胞群具有抑制免疫效应的作用，能特异性抑制T细胞对外源和自体抗原的免疫反应，因此在维持对自身成分免疫耐受的同时，也可能阻止机体对自体同源肿瘤细胞的免疫。目前普遍认为，CD4+CD25+Treg很可能影响免疫系统对肿瘤抗原的应答，从而影响肿瘤的发生和发展。Foxp3是特异性地表达于CD4+CD25+Treg表面的一种转录因子，可作为该类细胞的特异标志，并调节其发育和功能。

本文通过检测非小细胞肺癌患者外周血中CD4+CD25+Treg的数量变化及其相关基因Foxp3 mRNA的表达，探讨CD4+CD25+Treg与非小细胞肺癌发生、发展的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

非小细胞肺癌手术患者（肺癌组）40例，术后均经病理切片证实，其中，男31例，女9例，年龄37~69岁，平均48岁。鳞癌25例，腺癌15例。非肿瘤患者（对照组）30例，其中，男21例，女9例，平均年龄40岁。所有对象均于入院时抽取静脉血5 ml进行检测。

1.2 CD4+CD25+ Treg检测方法

参考文献[1]，取静脉血2 ml，肝素抗凝，梯度离心分离淋巴细胞，以不完全1640培养基洗涤2次，再以含1%胎牛血清的完全1640培养基重悬细胞，计数淋巴细胞，稀释细胞浓度至1×106/ml，取1 ml细胞悬液置于试管中，放入冰箱备用。用时取上述细胞悬液，1 500 r/min离心10 min，弃上清，取FITC标记的CD4抗体和PE标记的CD25抗体各20 μl。各管加入单抗后置4℃冰箱中避光孵育30 min，后加入1%BAS-PBS液离心并洗涤2次，稀释至300 μl移入试管中，上流式细胞分析仪。用Becton Dikison FACS Calibur流式细胞仪测定淋巴细胞表面各种荧光素的荧光强度，用空白对照和阴性对照消除自发荧光和非特异荧光的干扰。荧光强度以二维dot-plot散点图储存于电脑中。自动分析结合某一单抗的阳性细胞个数和百分比，在FITC-CD4/PE-CD25双参数图上计算得到CD4+CD25+调节性T细胞的比例：CD4+CD25+调节性T细胞百分比=CD4+CD25+调节性T细胞/CD4+T细胞×100%。

1.3 RT-PCR法检测Foxp3的表达

①RNA提取和cDNA合成：用Trizol试剂提取淋巴细胞总RNA，用反转录试剂提供的标准条件进行反转录反应，所获取的cDNA作为PCR反应模板。②扩增Foxp3 mRNA，引物序列为上游：5'-CTA CGC CAC GCT CAT CCG CTG G-3'，下游：5'-GTA GGG TTG GAA CAC CTG CTG GG-3'。内参照采用hprt，引物序列为上游：5'-CCT GCT GGA TTA CAT TAA AGC ACT-3'，下游：5'-GTC AAG GGC ATA TCC AAC AAC AAA-3'。③PCR反应体系为25 μl。条件：94℃ 3 min预变性后开始循环，94℃变性30 s，52℃复性30 s,72℃延伸1 min,共35个循环，最后于72℃延伸7 min，扩增产物为447 bp。④取5 μl PCR产物和内参照hprt的PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，用电泳凝胶成像自动分析系统进行半定量分析。

1.4 统计学方法

数据以均数±标准差（x±s）表示，均用SPSS 12.0软件进行分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌组与非肿瘤组外周血CD4+CD25+调节性T细胞比例的比较（表1）

检测不同组别外周血中的CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞的比例，结果显示，肺鳞癌患者的比例为（14.85±6.74）%，肺腺癌患者的比例为（15.39±6.52）%，均较非肿瘤组[（8.97±5.53）%]明显增高（P0.05）。

表1 肺癌组与非肿瘤组外周血CD4+CD25+调节性T细胞的比例

2.2 肺癌患者外周血PBMC中Foxp3 mRNA表达

应用RT-PCR技术对肺癌患者的外周血PBMC中CD4+CD25+调节性T细胞特异性标志――Foxp3的mRNA表达水平进行了检测。结果显示，肺鳞癌和肺腺癌的患者外周血中Foxp3 mRNA表达量分别为（18.97±7.54）和（31.86±9.72），均明显高于非肿瘤患者（P

3 讨论

在生理状态下，机体免疫系统具有免疫监视作用，能有效防止肿瘤的发生。很多研究表明，在癌症患者中免疫系统对肿瘤抗原的反应明显下降，从而不能有效地限制、清除肿瘤细胞，这与肿瘤的发生有密切的关系。目前一般认为，这种对肿瘤抗原弱免疫应答的原因可能是由于肿瘤抗原为变化了的自身抗原，也可能是由于机体免疫功能的下调，即免疫稳态的破坏。

正常情况下，机体内CD4+CD25+Treg的免疫学意义正是维持机体免疫稳态，动态调节机体免疫平衡。当体内CD4+CD25+ Treg数目减少或功能不足时，会出现相应的免疫性损害，甚至出现自身免疫性疾病，这种情况在很多疾病中得到了证实。但对于CD4+CD25+Treg数目增多或功能增强的研究还不多见，目前在国外也只是集中在部分肿瘤的研究中。例如，Ormandy等[2]研究证实肝癌患者外周血和肿瘤浸润淋巴组织中CD4+CD25+Treg数目明显上升。部分学者在对胃癌患者的研究中[3，4]也得到了相同的结果。Shimizu等[5]证实去除CD4+CD25+Treg可诱导对同源肿瘤细胞的免疫应答，也可以促进肿瘤病变部位的前炎症反应，从而利于诱导对多种肿瘤抗原的免疫应答，证明了CD4+CD25+Treg可以抑制体内抗肿瘤反应。

2003年，Hori及Fontenot等[6,7]研究小组同时报道Foxp3转录因子特异性地表达于CD4+CD25+Treg细胞，对其发育和发挥功能起着关键作用，可作为其特异性标志。与其他表面标志不同，Foxp3并不上调表达于活化的CD4+效应T细胞，而是持续表达于调节性T细胞，推测Foxp3的表达可能是导致细胞发挥其免疫抑制作用的主要原因。

本研究结果表明，非肿瘤组外周血中的CD4+CD25+Treg细胞比例为（8.97±5.53）%，与国外文献报道的5%~10%相符，肺鳞癌和肺腺癌患者的比例均明显高于非肿瘤组（P

[参考文献]

[1]张育超,王惠英,罗招凡.胃癌患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的变化[J].实用医学杂志，2007，23(17)：2675-2676.

[2]Ormandy LA, Hillemann T, Wedemeyer H, et al. Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma [J]. Cancer Res,2005,65(6):2457-2464.

[3]Ichihara F, Kono K, Takahashi A, et al. Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood and tumor-infiltrating lymphocytes in patients with gastric and esophageal cancers [J]. Clin Cancer Res,2003,9(12):4404-4408.

[4]Kawaida H, Kono K, Takahashi A, et al. Distributions of CD4+CD25+ regulatory T cells in tumor draining lymph nodes in patients with gastric cancer [J]. J Surg Res,2005,124(1):151-157.

[5]Shimizu J, Yamazaki S, Sakaguchi S. Induction of tumor immunity by removing CD4+CD25+ T cells: a common basis between tumor immunity and autoimmunity [J]. J Immunol,1999,163:5211.

[6]Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.[J]. Science,2003,299(5609):1057-1061.

[7]Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells [J]. Nat Immunol,2003,4(4):330-336.

（收稿日期：2008-10-12）