金针菇液体菌种培养基及培养条件的优化
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摘 要：液体菌种的应用是金针菇工厂化生产的关键技术和发展趋势。本研究以金针菇21作为供试菌株，通过摇瓶培养，比较了不同碳源和氮源对液体菌种质量的影响，结果发现，玉米粉为最佳碳源，麸皮为最佳氮源；通过正交试验对培养条件进行优化，结果显示，摇床转速150 r/min、装液量60 mL（三角瓶，250 mL容量）、接种量12%（V/V）、培养温度22℃时所得液体菌种质量最优，菌丝干质量达1.821 5 g/100 mL。栽培试验结果显示，菌龄5 d的液体菌种最适合栽培应用，栽培周期比使用固体菌种短，产量也高约5.8%。
中图分类号：S646.1+5 文献
金针菇（Flammulina velutipes）是一种优质食用菌，富含蛋白质、氨基酸、维生素、矿质元素等多种营养物质[1]，以及朴菇素（Flammutn）、蒜菇素、金针菇原素（Flamn）等功能活性成分，具有抗肿瘤、调节免疫力、促进智力发育、护肝等作用[2]，早已成为人们熟知的保健食品。随着技术的革新和国内外市场需求的增长，金针菇生产方式已由传统作坊式、季节性生产，向设施化、工厂化生产方式转变[3]。作为金针菇工厂化栽培的关键技术之一，液体菌种具有生产周期短、接种便利、菌丝分散性好、萌发点多、生长快、成品率高等优点，液体菌种的应用已成为食用菌菌种及规模化、工厂化生产的发展趋势[4]。本研究采用液体摇瓶培养，对金针菇液体菌种的培养基和培养条件进行了优化，以期为金针菇栽培技术的提升提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验菌株
金针菇21，购自华中农业大学菌种实验中心。
1.2 培养基
①碳源筛选培养基 在基础培养基（蛋白胨1%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.05%，维生素B1 1 mg/L） 中，分别加入2%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉4种碳源，121～126℃灭菌20 min，冷却备用。
②氮源筛选培养基 在基础培养基（葡萄糖2%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.05%，维生素B1 1 mg/L） 中，分别加入2%的蛋白胨、酵母膏、麸皮3种氮源，灭菌，备用。
③培养条件优化培养基 玉米粉2%、麸皮1%、酵母粉0.5%、葡萄糖1%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 0.05%、CaCO3 0.2%、维生素B1 1 mg/L。
④固体菌种培养基 小麦98%、白糖1%、石膏1%。小麦在清水中浸泡6～8 h，吸足水分，然后煮熟（不开粒），捞出沥干水，加入石膏粉、白糖拌匀，分装瓶中，灭菌，备用。
⑤栽培培养基 棉籽壳培养基（干料）：棉籽壳78%、麸皮20%、蔗糖1%、CaCO3 1%，加水搅拌至含水量60%，装袋（每袋折合干料300 g），灭菌，冷却待用。
1.3 菌种活化
菌种斜面接种到PDA平板，25℃恒温培养8 d，备用。
1.4 碳源、氮源的筛选
每种不同培养基设置3个重复，用直径0.2 cm的打孔器在活化的菌种平板上打孔，摇瓶容量250 mL，装液量70 mL，接活化菌种5块，25℃静置24 h后，150 r/min摇瓶培养5 d，观察菌丝球形态，测定菌丝体生物量。
1.5 菌丝体生物量测定
取50 mL摇匀的培养液，过滤收集菌丝，蒸馏水洗涤至水变清后，将菌丝球置于恒重过的定性滤纸之上，于干燥箱60℃烘至恒重后称量[5]。
1.6 液体菌种培养条件的优化
①一级种子的制备 将PDA活化的菌种经打孔后接种到液体培养基，恒温25℃，150 r/min条件下培养2 d，作为种子备用。
②摇瓶发酵条件的优化 三角瓶容量250 mL，接种上述种子液进行摇瓶发酵，根据已有报道[5～7]，以摇床转速、装液量、接种量及培养温度为4个因素，采用L9（34）正交试验设计，详见表1，共培养
5 d，以菌丝体生物量为考察指标，进行培养条件优化，获得最佳摇瓶发酵培养条件。
1.7 最佳接种菌龄的确定
发酵培养基在最优条件下制备液体菌种，菌龄分别设4、5、6 d三组，经轻微绞碎后，接种到棉籽壳培养基，每组20袋，观察菌丝长满所耗的时间及菌丝的生长状况。
1.8 固体菌种的制备
将活化好的PDA菌种平板接种到麦粒菌种培养基，在25℃、相对湿度75%左右条件下培养至满袋后，继续培养1周，待用。
1.9 出菇试验
分别将固体和液体菌种（菌龄5 d）接种10 g（或10 mL）到棉籽壳培养基中，各50袋，24℃、相对湿度75%左右条件下培养至满袋，继续1周后转入13～14℃菇房，相对湿度85%～90%，出菇两茬[8]，记录长满、现蕾时间及鲜菇产量，计算生物学效率，生物学效率（%）=子实体鲜质量/培养基干质量×100%。
2 结果与分析
2.1 不同碳源对金针菇菌丝体生长的影响
以不同碳源进行金针菇液体培养均能收获菌丝，但所得菌丝干质量差异较大（表2）。葡萄糖和蔗糖产生的菌丝体较少，分别只有1.136 2和 1.051 1 g/100 mL，而天然性的碳源玉米粉和可溶性淀粉产生的菌丝体干质量较大，最多达1.630 5 g/100 mL，菌丝球的形态也较优。分析原因可能是天然成分中含有有利于菌丝生长的生长因子，而葡萄糖可能具有碳代谢抑制效应，形成反馈抑制作用，不利于碳源的吸收与利用。
2.2 不同氮源对金针菇菌丝体生长的影响
3种氮源中，NH4NO3组获得的菌丝干质量最少，只有0.631 2 g/100 mL，说明NH4NO3被真菌菌丝利用得很少，在栽培过程中添加NH4NO3的意义也不大；蛋白胨作为一种半人工氮源，促进金针菇生长的作用表现一般；麸皮组中菌丝的得率最高，达1.531 9 g/100 mL，菌丝球的形态也最好，这与现实应用中常以麸皮作为辅助材料是一致的（表3）。
2.3 摇瓶培养条件的优化
①正交试验结果 对转速、装液量、接种量、培养温度4因素3水平的正交设计试验优化结果见表4。极差分析表明，A>D>C>B，说明摇床转速对液体菌种的菌体生长影响最大，其次为培养温度，再次为种子液的接种量，装液量对菌丝得率的影响最小。
理论最优的培养条件为A2B2C3D2，即摇床转速150 r/min、装液量60 mL、接种量12%、培养温度22℃。
②验证性试验 为了进一步检验正交试验结果的可靠性，按上述最优培养条件进行验证试验，3次重复，肉眼观察发现菌丝球大小较均匀，浓度高，密度较大，经测定所得菌丝干质量为1.821 5 g/100 mL。结果表明，在优化后的培养条件下进行菌种液体培养具有较好的重复性，说明正交试验结果是可信的。
2.4 液体菌种的应用
①最佳菌龄的确定 分别将经过4、5、6 d发酵的液体菌种接种到棉籽壳培养基上后，满袋天数分别为27、25、28 d，其中发酵5 d的菌种满袋所需时间最短，菌丝健壮，长势旺。
②出菇试验结果 栽培试验中2种不同菌种接种的菌袋出菇过程的相关记录见表5。液体菌种栽培袋长满时间要比固体菌种提早9 d，头潮菇采收早7 d，二潮菇早9 d，总产量约高出5.8%。
3 小结与讨论
通过对不同碳源和氮源进行筛选，发现以玉米粉为碳源、麸皮为氮源制备金针菇21菌株液态菌种的效果较好。在此基础上进行培养条件的优化，发现当摇床转速150 r/min、装液量60 mL（三角瓶，250 mL容量）、接种量12%、培养温度22℃时所得液体菌种质量最优，菌丝干质量达1.821 5 g/100 mL。该条件下生产的液体菌种在出菇试验后发现菌丝的生长时间、出菇时间都相应提前，有效地缩短了生产周期，并且产量有所提高。
碳源和氮源是食用菌最主要的营养物质，它们几乎参与细胞代谢一切的过程。金针菇能利用的碳源和氮源范围很广[9]，通常复合型的优于单一型的，有机态优于无机态。本试验筛选的结果显示，较好的碳氮源分别是玉米粉和麸皮。除了碳、氮源等主要营养元素外，包括无机盐、生长因子等其他营养成分对金针菇的生长发育的影响也十分明显，不少研究者作了很多工作[5，9]。不同菌株特异性不同，所以在营养需求上略有差异，有必要从实验室研究[10]和栽培实践[7，11]两方面协同深入。
液体菌种的培养条件中温度是相对较为敏感的因素，有研究者发现25℃是金针菇液体菌种的最适培养温度[6，11]，本试验发现最适温度为22℃，与黄仁术[5]的结果一致。本试验优化后的最优转速与陈力力等[6]和闫长伟等[7]的结果略有差异，极差分析显示，转速对菌种的影响最大，分析原因可能是正交设计的转速差距较大造成的。摇瓶培养过程中，较高转速通常会导致菌丝球过于紧密，限制其生长，从而影响菌丝生物量，相反，转速过低又会影响营养物质的传导和溶氧量，不利于生物量的积累和菌丝活力的保持。目前，生产实践中，多采用发酵罐液体深层发酵，与摇瓶不同的是需要考察螺旋桨[11]对菌丝的剪切力和通气量[10，12]等指标，较摇瓶发酵更为精确。
由于出菇试验是小规模袋式栽培，管理过程中参数波动幅度较大[13]，导致两组试验总体的生物转化率都偏低。另外，摇瓶发酵的液体菌种菌丝活力会略逊于液体深层发酵，使得液体菌种的优势发挥也不充分。所以，出菇试验的结果只是在一定程度上说明了液体菌种在栽培上有优势，在生产实践上的应用有待进一步细致深入的分析。
参考文献
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