微生物产弹性蛋白酶
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关键词：微生物；弹性蛋白酶；发酵
中图分类号：Q556+.9文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)01-0050-04
Progress in Microbial Production of Elastase
FANG Shang-ling, HU Jia-jun
（College of Biochemical Engineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China）
弹性蛋白酶（elastase）是一种以分解不溶性弹性蛋白质为特征的广谱蛋白水解酶，主要存在于动物胰脏中，以及皮肤、主动脉、血小板和白血球中。在微生物类群中也广有分布，细菌、放线菌、真菌中都有分泌胞外弹性蛋白酶的报道[1]。弹性蛋白酶可由动物胰脏提取或由微生物发酵制得[2]。由动物提取纯化的弹性蛋白酶是一种肽链内切酶，由240个氨基酸残基组成，相对分子质量为25 900，等电点为pI 9.5[3]。来源不同的微生物弹性蛋白酶都能降解其天然底物――弹性硬蛋白质。同功不同源蛋白酶的特点、性质、相对分子质量和等电点等有所差异，但都是一种广谱的肽链内切酶，具有较广泛的水解特性[4]。
目前，弹性蛋白酶主要作为治疗高脂血症、防治动脉粥样硬化症的生化药物，治疗确切，安全可靠。我国生产弹性蛋白酶主要由猪胰脏提取，原料来源有限制，且酶含量不高，每1 kg鲜胰脏含弹性蛋白酶仅210 000 U，限制了生产的发展。微生物弹性蛋白酶与胰弹性蛋白酶一样，具有较广的水解特性，不但能降解弹性蛋白，而且能分解酪蛋白、明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质，是一种广谱的肽链内切酶。国外，药用弹性蛋白酶有通过动物胰脏提取，也有发酵生产，其效果相似[1]。利用微生物发酵大规模工业化生产弹性蛋白酶不仅能提供足够的治疗用药物酶，也能为开拓该酶其他方面的应用提供充足的酶源。
1微生物来源弹性蛋白酶的国内外研究情况
弹性蛋白酶最初是1949年由Balo等从胰脏中分离纯化出来，并指出其含量水平与动脉粥样硬化症有关。从此对该酶的研究一直很活跃。
1960年Mandl等从牙周病患者的送检样品中首次分离出产胞外弹性蛋白酶的微生物Flavobaterium clastdyticum，并从它的培养液中分离纯化出专一降解弹性蛋白的菌源性弹性蛋白酶。此后从细菌、霉菌、放线菌中相继分离出产酶菌株及其菌源弹性蛋白酶，但初期主要集中于医学微生物病原学的研究。70年代中期以来，日本和前苏联学者对微生物发酵生产弹性蛋白酶进行了大量的研究，并申报了许多专利菌种。其中研究比较详尽的是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa IFO3455）。另外，1974年，Shiio等从自然界取样分离的Flavobacterium immotum 9-35具有很强的弹性蛋白酶分泌能力。后来分离出1株利福平抗性的高产突变株Flavobacterium R-102-87，在以葡萄糖、干酪素为营养源的发酵培养基中，30 ℃振荡培养24 h，酶产量达145U/mL（40 ℃，20 min，使1.0 mg地衣红-弹性蛋白质完全溶解的酶量为1U）。
前苏联学者对放线菌属和曲霉属菌株产弹性蛋白酶研究较多。放线菌属产弹性蛋白酶的代表菌株是Actinomyces rimosus和Actinomyces fradiae119。将Actinomyces rimosus所产的酶纯化并与胰弹性酶比较，发现除相对分子质量较大外，其它性质及水解专一性都与胰源酶十分相似。
真菌中产弹性蛋白酶的高产菌株是曲霉属，前苏联Parksrskyte等选出的弹性蛋白酶高产菌Aspergillus versicolor 837，在以硫酸铵为氮源的马铃薯汁培养基深层液体培养48 h，然后强烈通风培养4 d，培养液积聚大量胞外弹性蛋白酶。
我国对微生物产弹性蛋白酶的研究则少见文献报道，直到上世纪90年代才有颜子颖等[5]关于芳香黄杆菌产弹性蛋白酶菌种筛选、发酵条件研究及酶分离纯化等方面的报道。他们分离的黄杆菌Flavobacterium sp.17-87在30℃，摇瓶培养24 h，弹性蛋白酶产量达120 U/mL，并从中成功地分离出了黄杆菌弹性蛋白酶结晶。
随后，曹军等[6]从不同省区采集的500多个土样中分离得到多株产弹性蛋白酶菌株，主要集中在黄杆菌属和色杆菌属中。经细胞工程技术处理后，黄杆菌属中F-122菌摇瓶发酵产酶能力达到240 U/mL，活力比原始菌株提高了58%。
陈启和等[7]从土壤中也筛选到一株高产弹性蛋白酶的芽孢杆菌（EL3），其酶活达100 U/mL。经过诱变选育、培养基优化等系列研究，获得了大幅度提高酶活性的培养条件。陈丽娟等[8]对枯草芽孢杆菌产弹性酶及提纯工艺进行了较为深入的研究。王娟丽等[9]从土壤中筛选了一株弹性蛋白酶高产菌株Bacillus pseudofirmus EL112，酶活性也达100 U/mL。据hiio等报道，产酶活性达155 U/mL，具备了工业化生产价值。
2微生物产弹性蛋白酶的特征
微生物产生的弹性蛋白酶在结构特征上，具有2个标志性特征：（1）与弹性蛋白质有高亲和力；（2）酶切位点在脂肪族氨基酸羧基参与形成的肽键上。虽然不同来源的弹性蛋白酶的特点、性质、相对分子质量不尽相同，但迄今为止所有分离的弹性蛋白酶最适作用pH均在7.0以上，属于碱性弹性蛋白酶，酸性弹性蛋白酶尚未见报道。与其它的碱性蛋白酶不同，碱性弹性蛋白酶对甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）残基有很高的水解特异性。弹性蛋白中Ala、Gly含量高达55%。这也解释了弹性蛋白酶能高效降解弹性蛋白质的原因。
弹性蛋白酶的水解机制，是首先使弹性蛋白质的结构变疏松并溶解，然后将已溶解的弹性蛋白质降解成可溶的多肽及氨基酸。弹性蛋白质在碱性环境下易变性，结构疏松，有利于弹性蛋白酶对其水解。从嗜碱菌中筛选得到的菌株所产弹性蛋白酶有较高的最适反应pH，其降解弹性蛋白质的酶活性也高。
现已发现的微生物产弹性蛋白酶根据等电点可分为2类：（1）等电点在碱性的弹性蛋白酶，其与底物之间的结合力主要为静电作用力，如芽孢杆菌属（Bacillus）、放线菌属（Actinomyces）、黄杆菌属（Flavobacterium）产的弹性蛋白酶。嗜碱芽孢杆菌Ya-B产的弹性蛋白酶几乎所有正电荷残基都集中在分子表面，这有利于该酶与弹性蛋白质结合。当pH高于弹性蛋白酶的等电点时，弹性蛋白酶失去边面正电荷，与弹性蛋白质的结合率显著下降；（2）等电点在酸性的弹性蛋白酶，其与底物弹性蛋白质之间的结合力主要为疏水作用力，NaCl不能抑制该酶的活性。如：铜绿假单胞菌产的弹性蛋白酶、人胰腺中的弹性蛋白酶、Myxococcus xanthus产的MAP1。Ca2+对保持酶活力，防止酶自身降解必不可少。Micrococcus luteus[8]产生的碱性弹性蛋白酶在Ca2+存在下，在pH6.0～10.5之间、57 ℃以下稳定；EDTA可通过与Ca2+ 结合完全抑制酶活性并导致酶的自溶。
3微生物弹性蛋白酶的基因工程和蛋白质工程进展
3.1弹性蛋白酶的基因克隆和表达
采用分子生物学技术克隆目的基因构建工程菌株，是各国微生物学家的研究热点。弹性蛋白酶基因的克隆和表达，可从理论上解释弹性蛋白酶的转录表达及酶学反应机制，并为该酶实现工业化生产打下基础。1987年，胰弹性蛋白酶的基因首次被克隆，并在E.coli LE392中表达成功[10]。Yoda等在E.coli-B.subtilis的穿梭载体pHY300pLK的基础上，构建含弹性蛋白酶基因的质粒，将Bacillus的碱性弹性蛋白酶的基因克隆到B.subltils中得以表达。表达菌产酶为73 U/mL。
Ryuta 等于1989年克隆了嗜碱芽孢杆菌Ya-B的碱性弹性蛋白酶基因（ale）并测得其核苷酸序列，推出其氨基酸序列，从分子机制解释弹性蛋白酶具有高的最适反应pH及高酶活性的原因。该基因共编码378个氨基酸，其中包含27个氨基酸的信号肽及83个氨基酸的前导序列，成熟酶蛋白由268个氨基酸组成。他们将该基因克隆到表达载体，分别转化到E.coli K-12和B.subtilis DB104中，在后者中检测到了目的基因的表达。
Chang等[11]深入研究了该酶的信号肽及前导序列的功能，将ale基因的信号肽及前导序列分别克隆表达。结果表明，弹性蛋白酶Ya-B的正确折叠形成有活性的蛋白酶的过程发生在细胞外，此过程需要分泌于胞外的前导序列的协助。Yeh等[12]将ale基因的起始密码子UUG突变为GUG，AUG，提高了ale在B.subtilis DB104及ale基因缺陷型突变株YaB-DEC中的表达。
黄春基等[13]用PCR扩增及克隆铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶基因。方法是从铜绿假单胞菌培养物中提取染色体DNA，PCR扩增弹性蛋白酶基因成熟蛋白编码区，A-T克隆于pMD18-T载体中，对重组质粒进行酶切和测序鉴定。结果从高GC含量的铜绿假单胞菌染色体DNA中扩增到弹性蛋白酶基因并进行了克隆与鉴定，该研究实现了活性弹性蛋白酶的高效表达。
3.2蛋白质工程改造弹性蛋白酶
Mei等[14]以枯草杆菌弹性蛋白酶BPN、枯草杆菌弹性蛋白酶Carlsberg为模板，用计算机构建了elastase YaB的三维结构模型。对位于S1底物结合口袋两侧的甘氨酸-124（Gly124）、甘氨酸-151（Gly151）定点突变，用带有较大侧链的碱基的结合切割。突变蛋白基因在Bacillus subtilis DB104中表达，突变蛋白G124A，G124V，G151A对相应作用底物表现出比野生型高3～10倍的催化能力。同时，突变蛋白G124A、G124V的作用底物仅限于丙氨酸、甘氨酸，G151A仅限于丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸。
4微生物弹性蛋白酶的分离制备
微生物弹性蛋白酶是胞外酶，且等电点较高，分离纯化较为容易，可用离子交换法提纯。近来，也开始应用亲和吸附层析法[15]。
4.1离子交换法
森原和之等采用弱酸性阳离子交换树脂直接吸附绿脓杆菌IFO 3455发酵液中的弹性蛋白酶，分离该酶并取得成功。Shiio等应用类型法分别从产黄菌R-102-87和Actinomyces rimosus的发酵液中直接分离出弹性蛋白酶成分，从大体积发酵液中浓缩弹性蛋白酶组分十分理想，可达到分离和纯化的目的。
4.2亲和层析法
吴梧桐等以水不溶性弹性硬蛋白酶的天然底物作为亲和吸附剂装柱，应用酶和底物的亲和吸附力进行分离提纯，仅进一步柱层析即获得聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的胰弹性蛋白酶制品。颜子颖等[15]在对产黄菌sp17-87的研究中，应用该法分离出电泳均一纯的弹性蛋白酶。以160目牛颈韧带弹性蛋白质作为亲和吸附剂，纤维素粉为载体按1∶20混合装柱，控制层析条件可使酶与底物结合而不分解底物，从而达到分离该酶的目的。
5微生物弹性蛋白酶的应用
弹性蛋白酶的用途很广，目前由于主要从脏器中提取，产量小，价格高，限制了其应用。
弹性蛋白酶在医药方面主要作为治疗药物：（1）治疗高脂血症；（2）防治动脉粥样硬化；（3）抑制脂肪肝发展；（4）治疗慢性气管炎及其它结缔组织纤维增生性疾病；（5）外用于消除皮肤焦痂、碎屑，用于烧伤患者的治疗以及皮肤溃疡、口腔溃疡等症。由于胰弹性蛋白酶和菌源弹性蛋白酶性质有差别，虽然国外有报道菌源酶可替代胰源酶用作药品，但具体涉及到某一属菌株所产的酶，必须在药理、毒理及药效方面与胰源酶作充分的比较以确保疗效及安全性。
弹性蛋白酶可用于食品工业。许多动、植物蛋白质，特别是一些难以处理和食用的韧带、大动脉血管、筋腱等蛋白质废料都可被其降解，因此在农副产品深加工、高蛋白质食品的制作、罐头加工等方面将会得到广泛应用。
日用化学工业方面，弹性蛋白酶主要用于疗效化妆品的生产。国外近年有报道将弹性蛋白酶加入化妆品，可增进、改善皮肤血液循环，并改善皮肤脂质代谢，增强皮肤、毛发的弹性、柔性，延缓皮肤老化，减少皱纹及色素沉着，还能促进头发生长，防止脱发。研究表明，对呈老化现象的皮肤施以含弹性蛋白酶的化妆品，可明显的赋活皮肤细胞，皮肤角化程度减少，润湿程度增加。同时，应用廉价的微生物弹性蛋白酶将难以处理的动物颈、背韧带等废料制成高级化妆品原料，将大大简化工艺，减低成本，并变废为宝，
综上所述，应用生物工程技术，将有可能提供充足的新酶源。在国外，已经应用基因工程技术构建工程菌生产弹性蛋白酶，胰弹性蛋白酶基因已被克隆并在大肠杆菌392中表达成功。选育合适的菌种应用发酵技术实现大规模工业化生产，具有很好的经济效益和社会效益。
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