复合RT—PCR检测猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟及猪流感等3种病毒方法的建立

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇复合RT—PCR检测猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟及猪流感等3种病毒方法的建立范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要 为了快速准确地对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪流感病毒（SIV）进行诊断与鉴别诊断，特进行试验。根据GenBank上已发表的PRRSV的ORF7基因序列、CSFV的C基因序列和SIV的M基因序列，设计合成了3对特异引物，开展RT-PCR检测方法的研究。分别建立了PRRSV、CSFV和SIV的单项RT-PCR诊断方法，并最终建立了PRRSV、CSFV和SIV的复合rt-pcr诊断方法，可分别及同时扩增PRRSV 430 bp、CSFV 775 bp和SIV 225 bp的特异性片段。试验证明该方法适用于PRRSV、CSFV和SIV的诊断及鉴别诊断。

关键词 复合RT-PCR；检测；猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪瘟病毒；猪流感病毒

中图分类号 S852.65 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）17-0275-03

在引起猪繁殖和呼吸障碍的诸多病原中，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）和猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）是较为常见的RNA病毒。目前，这3种猪病已遍布美洲、亚洲、欧洲和非洲等世界各地，已成为规模化猪场的常发传染病[1]。PRRSV、CSFV、SIV 3种病毒严重危害养猪业的发展，而如何能够准确快速检测出病原，采取有针对性的措施，是控制此类疾病的前提[2]。虽先后有学者开展过用于PRRSV、CSFV、SIV诊断的病毒分离试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验及RT-PCR试验等，但存在不同程度的不足[2-3]，特别是当动物存在多种病原混合感染时，更难以用常规方法做出快速确诊[4]。复合RT-PCR技术既具有单纯的RT-PCR技术同样的优点，又可以经1次RT-PCR诊断就能同时检测鉴别多种病原，对混合感染病例的诊断优势更为显著[3，5]。本研究以PRRSV、CSFV、SIV为研究对象，旨在建立快速、特异和敏感的RT-PCR及复合RT-PCR诊断方法，同时为PRRS、CSF、SI防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪流感病毒（SIV）均由新疆畜牧科学院兽医研究所保存。Total RNA Extractor（Trizol）、DNA Marker DL 2000、10×Formaldehyde Gel-loading Buffer、One Step RNA PCR Kit均购自生工生物工程（上海）有限公司；DEPC水购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒诊断用引物基于GenBank报道的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒ORF7基因序列，扩增的片段为430 bp，引物序列为：5′-CAGTTCCAG CCAGTCAATCA-3′；5′-GCCCCGATTGAATAGGTG-3′；猪瘟病毒诊断用引物基于GenBank报道的猪瘟病毒C基因序列，扩增的片段为775 bp，引物序列为：5′-TCGTCAGTAGTTC GACG-3′；5′-TGCTCTTTTGGGGCTAT-3′；猪流感病毒诊断用引物基于GenBank报道的猪流感病毒M基因序列，扩增的片段为225 bp，引物序列为：5′-CTAACCGAGGTCGAAAC-3′；5′-GCGTCTACGCTGCAGTCC-3′。上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 病毒RNA的提取。取病毒液0.5 mL，加入1 mL Total RNA Extractor（Trizol）（上海生工生物有限公司），根据产品说明书进行RNA的提取，并将提取的RNA溶于40 μL DEPC水中。

1.2.2 单个RT-PCR扩增。根据设计的PRRSV、CSFV和SIV的引物，分别进行RT-PCR扩增。反应在3个0.2 mL的离心管中进行，采用25 μL反应体系。各反应成分分别为：10×One Step RNA Buffer 2.5 μL，25 mmoL/L MgCl2 5 μL，10 mmoL/L dNTP Mixture 2.5 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL，5 U/μL AMV RTase XL 0.5 μL，5 U/μL AMV-Optimized Taq 0.5 μL，20 μmoL/L 上下游特异性引物各0.5 μL，PRRSV、CSFV、SIV的RNA各0.5 μL，加RNase Free dH2O 12～25 μL。混匀后置于PCR仪（Biometra Tgradient 96 梯度PCR仪）中扩增。反应程序为：50 ℃ RT反应30 min；94 ℃ RTase失活2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，共进行30个循环，循环结束后72 ℃延伸10 min，最后降温至4 ℃结束。以1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。

1.2.3 复合RT-PCR检测方法的建立。反应在1个0.2 mL的离心管中进行，在25 μL反应体系中加入10×One Step RNA Buffer 2.5 μL，25 mmoL/L MgCl2 5 μL，10 mmoL/L dNTP Mixture 2.5 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL，5 U/μL AMV RTase XL 1 μL，5U/μL AMV-Optimized Taq 1 μL，20 μmoL/L 上下游特异性引物（PRRSV、CSFV、SIV）各0.5 μL，PRRSV、CSFV、SIV的RNA各1 μL，加RNase Free dH2O至25 μL。反应程序为：50 ℃ RT反应30 min；94 ℃ RTase失活2 min；94 ℃变性30 s，56.8 ℃复性30s，72 ℃延伸1 min，共进行30个循环，循环结束后72 ℃延伸10 min，最后降温至4 ℃结束。以1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。

1.2.4 RT-PCR敏感性测定。利用紫外分光光度计，分别在260 nm和280 nm条件下测定提取的PRRSV、CSFV和SIV的模板RNA，并计算其纯度和含量。然后将3种不同的模板进行10倍系列稀释，从每个稀释浓度中各取1 μL模板cDNA分别进行RT-PCR扩增，找出复合RT-PCR检测的最低浓度。

2 结果与分析

2.1 PRRSV、CSFV和SIV单个RT-PCR结果

2.1.1 PRRSV RT-PCR。电泳结果显示RT-PCR扩增出目的DN段与预期大小相当，RT-PCR产物纯化后，连接到pGEM-T载体中测序，序列分析表明，所克隆的目的DN段大小为430 bp，经BLAST对比，证明RT-PCR产物为预期目的DN段（图1）。

2.1.2 CSFV RT-PCR。电泳结果显示RT-PCR扩增出目的DN段与预期大小相当，RT-PCR产物纯化后，连接到pGEM-T载体中测序，序列分析表明，所克隆的目的DN段大小为775 bp，经BLAST对比，证明RT-PCR产物为预期目的DN段（图2）。

2.1.3 SIV RT-PCR。电泳结果显示RT-PCR扩增出目的DN段与预期大小相当，RT-PCR产物纯化后，连接到pGEM-T载体中测序，序列分析表明，所克隆的目的DN段大小为225 bp，经BLAST对比，证明RT-PCR产物为预期目的DN段（图3）。

2.2 复合RT-PCR

利用3种病毒的上、下游引物同时在一个PCR反应体系中成功地扩增出PRRSV基因组中的430 bp、CSFV基因组中的775 bp和SIV基因组中的225 bp 3个片段（图4）。

2.3 复合RT-PCR检测方法的敏感性

3种质量浓度约为1 μg/μL（20 μL超纯水所溶）病毒混合RNA的D206nm/D280nm为1.82，纯度达到标准。不同的模板cDNA进行10倍系列稀释，从每个稀释浓度中各取1 μL模板cDNA分别进行RT-PCR扩增，找出复合RT-PCR检测的最低浓度。结果表明，当模板分别稀释10、100和1 000倍的时仍然能够扩增出430 bp、775 bp和255 bp 3条带，但是当模板稀释10 000倍的时候就不能扩增出可以识别的条带，由此说明复合RT-PCR可以检测到扩增1 000 pg的PRRSV、CSFV及SIV模板cDNA（图5）。

3 结论与讨论

最近几年规模化养猪发展迅速，密集型饲养方式及猪群的跨区域流通加快了疾病的传播，因此患病猪群多呈现混合感染现象[6]。混合感染使得猪群的发病情况更加复杂，疫病预防和控制更加困难，发病、死亡猪群增多，养殖户的损失更加惨重，这是目前养猪业遇到的头疼的问题[7]。此外，猪流感还可以感染人，引起发病甚至死亡，对人类社会公共卫生安全带来极大的威胁[8]。

依靠病理解剖变化和常规病原分离方法对病原的混合感染或继发感染作出快速、准确的诊断是不切实际的。本研究利用扩增PRRSV、CSFV和SIV特异性片段的3对引物在一次PCR反应中扩增出430 bp、775 bp和225 bp的特异性片段，并能在模板稀释1 000倍时的中仍能检测出特异性条带。复合RT-PCR法具有特异、快速、简便等优点[9-11]，检测PRRSV、CSFV和SIV单独或混合感染病原只需3～5 h。试验建立的PRRSV、CSFV和SIV单个及复合RT-PCR诊断方法适用于单独或混合感染的快速检测，为生产实际和病原学研究等工作调查奠定了基础，也为临床上一些混合感染的病例或复杂发病情况下迅速准确的诊断、应急处理提供技术支持，具有非常重要的意义和广阔的应用前景。

4 参考文献

[1] 李海燕，于康震，辛晓光，等.部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定[J].动物医学进展，2003，24（3）：67-72.

[2] 刘辉，熊金凤，邹浩勇，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒和乙型脑炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立[J].华中农业大学学报，2008，27（1）：12-18.

[3] 刘建柱，瞿玉东，，等.多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒[J].中国兽医学报，2003，23（6）：535-537.

[4] 刘维全，刘海鹏，江禹，等.禽流感病毒、新城疫病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒多联PT-PCR诊断技术的建立[J].农业生物技术学报，2005，13（1）：92-95.

[5] 鲁承，金鑫，杨咏洁.多重PCR在猪传染性萎缩性鼻炎诊断中的应用[J].中国兽医杂志，2003，39（12）：7-9.

[6] 李兆龙，黄梅请，程晓霞，等.CSFV，SIV，PCV2，PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国农业通报，2010，26（23）：18-21.

[7] 王隆柏，周伦江，修金生，等.用RT-PCR方法检测猪瘟与猪蓝耳病混合感染[J].福建畜牧兽医，2012，34（1）：7-9.

[8] ARORA D J，NDIAYE M，DEA S，et al.Genomic study of hemagglutinins of swine influenza（H1 N1）viruses associated with acute and chronic respirat-ory diseases in pigs[J].Arch Virol，1997，42（2）：401-412.

[9] 吕晓丽，崔保安，陈红英，等.复合 RT-PCR 检测猪乙脑病毒和猪流感病毒方法的建立 [J].华南农业大学学报，2008，29（4）：79-82.

[10] 吕晓丽.猪乙脑病毒 RT-PCR、荧光定量PCR及多重RT-PCR诊断方法建立[D].郑州：河南农业大学，2008.

[11] 李小康.猪细小病毒 PCR 诊断方法建立及标准制订[D].郑州：河南农业大学，2007.