外源DNA导入番茄引起后代性状变异的初步研究

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摘要：通过提取大豆dna，采用浸胚法在不同的浓度和温度下来处理番茄种子，观察后代植株一系列生理指标的变化，通过用紫外分光光度法测定后代植株叶绿素含量，用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对植株同工酶（SOD）进行分析，发现经处理的番茄种子，后代植株性状产生变异：叶绿素总含量与对照相比出现增加，其中DNA浓度为136.50 μg/mL经4 ℃浸泡避光处理的番茄种子总叶绿素含量变化最大，比对照增加了116%；同工酶（SOD）谱带一致，没有新的谱带出现，但酶活发生了变化。

关键词：番茄；浸胚法；外源DNA；生理指标

中图分类号：F3文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）10-2344-03

Trait Variation of Offsprings from Tomato Transfermed by Exogenous DNA

DING Jin-ping

（Key Laboratory of Plant-Microbe Interactions，College of Life Science，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，Henan，China）

Abstract： Tomato seeds were treated in different concentrations of soybean DNA and temperature. Changes of a series of physiological indexes of the offsprings were observed. The content of chlorophyll of offsprings was determined by uv spectrophotometry. Polypropylene gel electrophoresis（PAGE）was used to analyze the peroxidase isozyme（SOD） of plants. Results showed that content of total chlorophyll was increased compared with contrast. When the DNA concentration was 136.50 μg/mL and tomato seeds were soaked lightly at 4 ℃， content of total chlorophyll had the biggest changes with increase of 116%. Band of peroxidase isozyme （SOD） was consistent. There was no new band， but the activity of enzyme was changed.

Key words： tomato； dip embryo law； exogenous DNA； physiological indicators

基金项目：河南省科技厅科技攻关项目（122102110213）；河南省基础与前沿技术研究项目（122300410149）

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）为茄科，茄属。它是一种含有多种维生素和营养成分的蔬菜，据营养学家研究测定，每人每天食用50～100 g鲜番茄，即可满足人体对几种维生素和矿物质的需要。另外，番茄中的番茄红素具有很强的抗氧化活性，能够抗衰老、降低心血管疾病的危险性和防癌等。但其蛋白质含量较少，如能将大豆的基因转入到番茄中，创造高蛋白含量的番茄品种，既能丰富其营养价值，又能拓宽番茄的遗传物质基础，丰富其遗传类型，创造新的种质资源。

利用外源DNA直接导入技术培育农作物新品种或创建新种质是20世纪70年代以来在中国创立的一个育种新途径。它以植物为受体，带有目的性状的外源遗传物质（总DNA）或目的基因为供体，进行直接导入，既不同于载体转化的基因工程技术，也有别于通过有性杂交实现植物间基因交流的传统育种方式。种胚浸泡法[1]（即浸胚法）是以供体的DNA溶液浸泡受体干种子的胚或萌动的种子，将外源DNA导入受体细胞，达到转化目的的一种外源DNA直接导入植物的方法，具有无需特殊设备，可行、简便、易操作的特点。浸胚法与其他育种方法相比有自己的优点：①导入体是含有目的性状基因的总DNA，有可能一次导入达到改良多基因控制的数量性状的目的，不需事先分离、提纯和克隆目的性状基因，导入操作方法简便易行，勿需特殊设备和条件。②不受供体种类限制，植物和动物等均可作为外源DNA的供体，具有广阔的应用前景。③能够实现远缘杂交不亲和植物间的遗传物质（基因）重组，获得各种有价值的变异新类型，丰富育种资源。

通过将供体外源总DN段导入受体中可以研究一些具有重大经济价值的农作物，而遗传背景差异极大的农艺性状是否能够通过DN段进行转移，是否为单基因或单基因控制的多基因决定的性状，从而为近期的基因工程课题选择打下了基础。有研究[2-4]表明，外源DNA导入作物可以获得10-3～10-1的遗传变异率。

1材料与方法

1.1供试材料

供体：大豆（豫豆29号）。

受体：番茄（MM）。

1.1.1试剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.8）、巯基乙醇、氮蓝四锉、甲硫氨酸、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺、过硫酸铵。

1.1.2主要仪器台式冷冻离心机（Eppendorf 5417C/R型），快速核酸/蛋白析仪，电泳仪（EPS601型）。

1.2方法

1.2.1外源DNA的诱导

1）大豆DNA的提取方法。采用CTAB法[5]，总DNA的纯度鉴定采用紫外吸收光谱，测得DNA浓度为136.50 μg/mL。测定结果表明，纯化后的供体总DNA溶液纯度符合诱导条件，用蒸馏水溶液配制DNA溶液。配制的DNA终浓度分别为136.50、273.00、341.25、477.700、546.00、682.50 μg/mL。

2）外源DNA的导入方法。用上述配制的同体积的不同浓度的DNA溶液分别浸泡番茄种子，并分别在4 ℃（A）、20 ℃（B）、25 ℃（C）和35 ℃（D）温度下暗处理24 h，同时用相同体积的双蒸水（ddH2O）浸泡番茄种子作对照，将种子在田间种植，重复3次。

1.2.2诱导后生理指标的测定方法

1）叶绿素含量测定方法。叶绿素含量的测定用乙醇浸提法[6]。首先取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品2 g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3 mL 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10 mL，继续研磨至组织变白。静置3～5 min。然后取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗，滤液流至100 mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中，用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入棕色容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至100 mL，摇匀。取叶绿体色素提取液在波长663、645、652 nm下测定吸光度，以95%乙醇为空白对照。求得吸收率，并根据公式计算出叶绿素a和叶绿素b的含量。在叶绿素测定时要注意两点：光照会造成叶绿素的迅速破坏，因此提取时要在黑暗中进行，动作要快[7]。注意在酸性条件下，叶绿素也会遭到破坏[8]。按照Arnon公式，分别计算植物材料中叶绿素a、b和总叶绿素的含量。叶绿素Ca=12.7 A663 -2.69 A645，叶绿素Cb=22.9 A645-4.68A663，总叶绿素C=20.21A645+8.02A663。

2）同工酶（SOD）测定方法。①同工酶的提取：采用李合生[9]的方法并略微改动。把取得的材料洗净吸干水分，将0.5 g叶片加入1 mL 14 ℃预冷的pH 为7.8 PBS，于冰浴中研磨成匀浆，转移到10 mL试管中，然后加缓冲液至5 mL，取2 mL与离心管中离心15 min，吸取上清液，分管装编号后放入20 ℃冰箱中冷藏备用。

②电泳：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法[10]，上层浓缩胶浓度4%、pH 6.7，下层分离胶浓度为10%、pH 8.9，每板15个进样孔，每孔上样20 uL，以pH 8.3的Tris-甘氨酸溶液为电极缓冲液、0.005%的溴酚蓝作指示剂，在温度为4 ℃下进行电泳，电泳开始时电流要小，控制在15～20 mA，30 min后加大电流至30～50 mA，约2～3 h，待指示剂移到接近凝胶正极末端停止电泳。

③凝胶染色[11]。染色液Ⅰ：0.200 3 g NBT，加50 mL蒸馏水溶解后，定容到100 mL；染色液Ⅱ：0.001 g核黄素，0.045 9磷酸二氢钠，1.186 g磷酸氢二钠，0.418 mL四甲基乙二胺，加50 mL蒸馏水定容到100 mL；染色液Ⅲ：0.002 9 g乙二胺四乙酸，0.062 4 g磷酸二氢钠，1.647 g磷酸氢二钠，加50 mL蒸馏水溶解后，定容到100 mL；将剥出的凝胶板浸入染色液Ⅰ中，黑暗中浸泡20 min，取出凝胶至染色液Ⅱ中，黑暗中浸泡15 min，再取出转移至染色液Ⅰ中，置于日光灯下光照20～30 min，直至蓝色背景上出现清晰透明的SOD谱带。倒掉染液并用蒸馏水洗净，照相，绘制图谱，并测量酶谱带相对迁移率Rf值。

Rf=

2结果与分析

2.1大豆DNA的电泳检测结果

提取的大豆DNA电泳结果如图1所示。由图1可知，大豆DNA约为20 000 bp。

2.2番茄叶片叶绿素含量的测定

由表1可知，试验组番茄植株的叶绿素含量发生了变化，与对照组相比，叶绿素含量增加了，其中DNA浓度为136.50 g/mL经4 ℃浸泡避光处理的番茄种子叶绿素含量变化最大，比对照组高116%，其余其他条件处理的番茄种子叶绿素含量均增加。还可以看出，在DNA浓度为273.00 g/mL的条件下经20 ℃浸泡避光处理的番茄种子叶绿素a的含量比对照低6%，其余的均比对照组高，但是变化量不是很明显；试验组植株叶片叶绿素b的含量均比对照组高，而且变化明显。

2.3番茄同工酶SOD分析

由图2可知，变异株与对照株的同工酶迁移率Rf1=0.48、Rf2=0.6具有相同的谱带；变异株的同工酶酶谱中，3-C即DNA浓度为341.25 μg/mL经过25 ℃处理的谱幅宽，颜色深，酶活性强；1-C即DNA浓度为136.50 μg/mL经过25 ℃处理的谱带颜色浅，酶活性弱。其余的酶谱带与对照相比差异不大。根据上述所知，后代变异植株的同工酶确实发生了变化。

3讨论

浸胚法导入外源DNA已经得到证实，王邕等[12]报道了外源DNA导入玉米引起后代性状变异，观察D0代变异株及D1代植株的性状，并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）对D0代植株及其供体进行了同工酶分析，从而初步证实了大豆DNA的功能片段已整合到了受体基因组内并得到了表达。刘传雪等[13]报道了应用浸胚法转化寒地水稻的遗传转化，发现后代产生了变异。国内外采用外源总DNA导入受体，不仅创造了大量有价值的种质资源，而且选育出的新品系已广泛应用于生产。这些都为浸胚法导入外源DNA后代变异提供了依据。本试验研究了外源DNA导入番茄后的变异性状，通过配制不同浓度的DNA溶液，在不同的条件下进行暗处理，发现叶绿素含量和同工酶有变化。但是对于这种变异是因为外源DNA导入引起的，还是由于基因突变引起的还不能确定，有待进一步的研究。

参考文献：

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[2] 许勇，周长久，王福钧，等.外源DNA注射茄子子房后代性状的变异[J].园艺学报，1991，18（1）：49-54.

[3] 黄骏麒，钱思颖，刘桂玲.外源海岛棉DNA诱导中棉性状的变异[J].江苏农业科学，1982（11）：18-20.

[4] 董伟，陈玲，吴勇 .黄瓜自花授粉后外源DNA导入技术研究[J].园艺学报，1993，20（20）：155-160.

[5] 陈庆山，刘春燕，吕东，等.大豆DNA提取基本原理的探讨[J].东北农业大学学报，2004（2）：129-134.

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[8] VERNON，L P. Spectrophotometric.determination of chlorophylls and pheophytina in plant extracts[J]. Anal Chem，1960，32（2）：1144-1150.

[9] 李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，2000.

[10] 叶华智.小麦与禾谷镰刀菌相互作用下病穗过氧化物酶和酯酶的变化[J].植物病理学报，1988，18（3）：169-174.

[11] 宋小青，赵晓瑜，刘建荣，等.玉米SOD的分离纯化与部分性质研究[J].中国生化药物志，2007，28（4）：260-263.

[12] 王邕，刘爱花，张耀华，等.外源DNA导入玉米引起后代性状变异的研究[J].云南农业科学，2006（2）：14-16.

[13] 刘传雪，潘国君，张淑华.应用浸胚法转化寒地水稻的试验研究[J].北方水稻，2009，39（2）：8-11.