矮丛蓝莓叶片愈伤组织培养的研究

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摘要:以2种矮丛蓝莓的幼叶为外植体,进行愈伤组织形成及分化的研究。结果表明,在WPM培养基中附加不同种类、浓度的激素,2种蓝莓均能产生愈伤组织并分化出不定芽;在1/2MS+IBA培养基中添加活性炭时,生根效果最好。对于2个品种而言,叶片基部均是适宜诱导愈伤组织的部位。

关键词:矮丛蓝莓;幼叶;愈伤组织

中图分类号:S663.9 文献标识码:A 文章编号:16749944(2010)10018504

1 引言

矮丛蓝莓(Vaccinium angustifolium),属杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)植物,主要分布在北美和欧洲,具有很高的保健和经济价值。在保健方面,其特定的抗氧化剂具有延缓衰老、抑制癌细胞活性、抵抗心脏疾病的作用;在经济方面,市场需求量大,应用范围广[1]。但是,矮丛蓝莓常规的种子繁殖周期长,难以满足规模化生产和批量上市的需要。因此,组织培养凭借其无性繁殖的独特优势,成为蓝莓脱毒与快速繁殖的主要途径。在组织培养研究中发现矮丛蓝莓的茎尖和茎段表面及内部都带菌,不利于外植体灭菌和建立无菌材料。而其幼叶灭菌相对容易,且外植体采集对原母株伤害小。因此,幼叶成为矮丛蓝莓组培时首选的接种材料。本文以2种矮丛蓝莓的幼叶为接种材料,系统研究了不同生长调节剂组合、不同光照、不同部位对愈伤组织诱导与分化的影响,及植株再生途径,以期为矮丛蓝莓组培苗工厂生产提供理论依据和技术支撑。

2 材料与方法

2.1 试验材料

以“北极星”(Polaris)、“美登”(Blomidon)2个品种为材料,取其新抽生并完全伸展的幼叶进行试验。

2.2 试验方法

2.2.1 材料处理

剪下幼叶后流水冲洗2h,在无菌操作台上按照70%酒精消毒30s,无菌水冲洗3次,0.05%氯化汞灭菌8min,无菌水冲洗8次的顺序进行材料表面灭菌。然后将幼叶用无菌滤纸吸干水分,备用。

2.2.2 叶片愈伤组织的诱导

将幼嫩叶片横切2~3刀,背面朝下,接种于培养基上,每瓶接种3~5个叶块,30d后观察统计愈伤组织诱导情况及生长状态,图1。

图1 叶片愈伤组织诱导

(1)不同生长调节剂组合对叶片愈伤组织诱导的影响。将叶片接种在WPM培养基上,添加不同浓度的6-BA、NAA、2,4-D,采用L9(34)正交试验做3因素3水平处理,30d统计出愈率和愈伤组织长势,具体处理见表1。

(2)叶片的不同部位对愈伤组织诱导的影响。将幼嫩叶片垂直主脉切割两刀,分成3个小叶块,接种在培养基WPM+6-BA1mg/L +NAA0.1mg/L+2,4-D2mg/L上,30d后观察统计叶片的出愈率和生长状况。

(3)不同光照条件对叶片愈伤组织诱导的影响。将幼嫩叶片分别进行全光培养、10d暗培养、20d暗培养,全暗培养,观察记录叶片的出愈率和生长状况,如图2。

图2 愈伤组织分化的不定芽

2.2.3 愈伤组织分化培养

将培养30d是生长良好的愈伤组织切成边长约为0.5cm的正方体的小块,接种于附加不同浓度生长调节剂的1/2MS分化培养基中,诱导愈伤组织产生不定芽。每瓶接种外植体3个,每处理接种30瓶,重复3次。30d统计不定芽诱导率,具体处理见表2。

2.2.4 壮苗及生根培养

不定芽增殖得到的植株表现细弱,为了让其生根,本研究在不添加任何生长调节剂的MS培养基进行壮苗培养。大约20d后,选择生长健壮的植株,在1/2MS培养基上诱导其生根,每个处理30瓶,每瓶一个单株,重复3次。30d后观察统计生根率及试管苗生长情况。具体处理见表3,图3,图4。

图3 生根培养

图4 含活性炭的生根培养

2.3 试验结果评测指标

出愈率(%)=诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体总数×100%;分化率(%)=已分化的愈伤组织个数/接种的愈伤组织总数×100%;生根率(%)=生根的外植体数/接种的外植体总数×100%。

3 结果与分析

3.1 叶片愈伤组织的诱导

3.1.1 不同生长调节剂组合对叶片愈伤组织诱导的影响

先将接种后的叶片置于黑暗环境进行培养,10d后取出转入光下培养。一段时间后,部分叶片有开始卷曲的迹象,随着培养时间的延长,叶缘处出现白色颗粒,此时标志出愈的开始,30d后统计结果见表4。

从表4极差分析可以看出,不同激素配比对“北极星”叶片愈伤组织诱导的效果是不同的。在3个因素中,对“北极星”叶片出愈率的影响由大到小的顺序为2,4-D>NAA>6-BA,这表明2,4-D对出愈率的影响最大,随着2,4-D浓度的升高,出愈率也呈上升趋势。通过K值比较,可以看出最适合幼嫩叶片愈伤组织诱导的处理为D5,出愈叶片17个,出愈率为42.5%,显著高于其他处理。所以WPM+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L +2,4-D2mg/L的培养基适宜“北极星”幼嫩叶片愈伤组织诱导。

通过对表5的极差分析可知,R越大表示该因素的影响作用越强,在3个因素中,对“美登”叶片出愈率的影响由大到小的顺序为2,4-D>NAA>6-BA,这表明2,4-D对出愈率的影响最大。通过K值比较,可以看出最适合幼嫩叶片愈伤组织诱导的处理为D3,出愈叶片16个,出愈率为44.44%,显著高于其他处理。所以WPM+6-BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+2,4-D2mg/L的培养基适宜“美登”幼嫩叶片愈伤组织诱导。

3.1.2 叶片的不同部位对愈伤组织诱导的影响

将“北极星”和“美登”幼嫩叶片,接种在培养基WPM+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L +2,4-D2mg/L上,诱导叶片产生愈伤组织。试验结果表明:叶片部位的不同,其出愈率和生长情况均呈现出很大的差异。从叶片基部至尖端,2个品种的出愈率逐渐降低。叶片基部出愈率最高,分别为63.33%、60%,显著的高于中部和尖端。并且其愈伤颜色较浅,米白色至浅黄色、松软、生长较好。叶片中部和叶片尖端的愈伤组织颜色较基部稍深,浅绿色至褐色,致密,有的水渍状。可见,对于两个品种而言,叶片基部均是适宜的诱导愈伤组织的部位。

3.1.3 不同光照条件对叶片愈伤组织诱导的影响

光照条件是叶片愈伤组织诱导和分化的一个重要因素,通常情况下,在离体培养过程中,不同的物种、同一物种的不同外植体甚至同一外植体的不同诱导阶段对光照的反应都有可能是不同的。本试验设置了4种处理,从试验结果来看,“北极星”和“美登”在全光培养、暗培养10d处理中,出愈率差异不显著,愈伤组织长势均较好,颜色从米白色至浅黄色,质地松软,生长较快。而暗培养10d后,出愈率均呈下降的趋势,愈伤组织生长出现缓慢,有的出现水渍状。当进行全暗培养时,愈伤组织出愈效果不好,有的变成褐色,有的出现水渍状,生长缓慢。综合来看,“北极星”和“美登”可在全光或暗培养10d下,进行愈伤组织诱导,愈伤质地无明显变化。

3.2 愈伤组织分化培养

将生长较好的“北极星”和“美登”愈伤组织接种到分化培养基上,愈伤组织继续膨大增殖,虽然增殖较慢,但20d后可以看到,愈伤组织的表面有白色透明的突起,标志着分化的开始。继续培养,可以得到绿色的小芽苗。30d后统计结果。

通过对表8的数据处理来看,2种蓝莓分化的效果都不是很好,只有各别处理出现了突起,分化出小芽,说明愈伤组织途径分化较慢,要求较高。从分化率高低来看,“北极星”在E6处理中,分化率最高,达到43.33%,与其他处理差异显著,并且此时愈伤组织长势较好,绿色、紧实、有光泽,出现小芽;“美登”在E5处理中分化率最高,达到46.67%,差异性显著,愈伤组织深绿色,紧致,出现突起,长势良好。

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3.3 壮苗及生根培养

壮苗后,生根培养约14d后,小苗底部开始形成白色的根点,20d左右即可长出小根,根白色。不同浓度IBA和活性炭用量对“北极星”和“美登”生根具有显著的影响。从表9可以看出,在不加IBA和活性炭的培养基中,均没有根形成。在附加不同浓度IBA和活性炭的培养基上,2种蓝莓均可生根,但生根效果不同。“北极星”以1/2MS+IBA 0.2mg/L+活性炭0.1%作为生根培养基效果最好,生根率达53.33%,根多、粗壮,与其他组合差异显著。“美登”以1/2MS+IBA0.1mg/L+活性炭0.1%生根率最高,达到66.67%,均匀整齐,植株生长健壮。

4 结语

前人[2~3]研究认为培养物愈伤组织的产生与6-BA的浓度成正比。高浓度的6-BA可以直接从茎和叶上诱导出愈伤组织,由愈伤组织形式不定芽。该试验中采用6-BA、NAA与2,4-D组合,结果发现:“北极星”最佳愈伤组织诱导培养基为WPM+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L + 2,4-D2mg/L;“美登”最佳愈伤组织诱导培养基为WPM+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+ 2,4-D2mg/L。有试验证明:以叶片基部、中部、尖端为外植体进行培养,培养前期愈伤组织分化差别不大,但是后期基部先分化,出苗率最高,中部次之,尖端分化出芽时间最长[4]。该试验以矮丛蓝莓叶片基部、中部、尖端为材料进行愈伤组织诱导,发现基部愈伤化最快,中部次之,尖端最慢。从光照的影响来看,“北极星”和“美登”可在全光或暗培养10d下,进行愈伤组织诱导,愈伤质地无明显变化。

该试验采用1/ 2MS 基本培养基,并分别添加IBA、活性炭进行不定根诱导。结果发现:“北极星”以1/2MS+IBA 0.2mg/L+活性炭0.1%作为生根培养基效果最好,根多,粗壮;“美登”以1/2MS+IBA0.1mg/L+活性炭0.1%生根率最高,植株生长健壮。与汤桂钧[5]以1/ 2MS为基本培养基,添加活性炭0.1%有助于高山杜鹃生根,生根率为100%的结论相同。

参考文献:

[1] 李亚东.越橘栽培与加工利用[M].长春:吉林科学技术出版社,2001.

[2] 刘庆忠,赵红军.高灌蓝浆果的组织培养及快速繁殖[J].植物生理学通讯,2002,38 (3) : 253.

[3] 王侠礼,钟士传,琴亚琴,等.美国高灌蓝浆果的引进及微体快繁技术的研究[J].中国种业,2003 (12) :40~41.

[4] 刘树英,张志东,吴林,等.兔眼越橘芽增生诱导培养基及激素的筛选[J].吉林农业大学学报,2002,24(1):55~57.

[5] 汤桂钧,张建安,蒋建平,等.高山杜鹃的组织培养快速繁殖技术研究[J].上海农业学报,2004 ,20(3):15~18.

Study on Callus Culture of V. Angustifolium Leaves

Wang Xinmiao, Yang Lei, Zhang Hailin

(Yi Chun Forestry School in Hei Long Jiang, Yi Chun 153000,China)

Abstract:Taking the tender leaves of two species of V.angustifoliums as explants , this paper studies the formation and differentation of their callus. Accoring to the results, it is proved that both of the tender leaves can induce callus and adventitious bud when WPM medium is supplemented with different kinds and concentrations of the hormone, and the best rooting effect apperas in the 1/2MS+IBA medium supplemented with active carbon (AC); for the two species, the leaf base are the suitable position for callus induction.

Key words: V.angustifolium;tender leaf;Callus

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