内质网应激在脓毒症大鼠心肌损伤中的作用

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【摘要】 目的：研究内质网应激与脓毒症大鼠心肌损伤的关系。方法：35只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为假手术组（n=7）和模型组（n=28），模型组下设2、6、12、24 h 四个时相点 ，每个时相点7只。采用自动生化分析仪检测大鼠血CK-MB及cTnI水平。采用HE染色检测心肌损伤情况，免疫组化技术检测心肌组织ERS标志物GRP78蛋白表达。结果：（1）模型组大鼠6、12、24 h血清CK-MB及cTnI均较对照组显著升高（P

【关键词】 脓毒症； 内质网应激； GRP78； 心肌损伤

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.16.005

脓毒症是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中，是机体对感染的一种全身性炎性反应，是严重感染、重度创伤、大手术后、重症胰腺炎和休克等常见的并发症，常导致心、肺、肾、胃肠道、血液系统等重要器官损伤，其中心肌损伤无疑具有至关重要的作用。而关于脓毒症所致心肌损伤的机制，目前已知的有氧化应激、细胞凋亡、NO水平失调等[1-2]，近年有研究表明，内质网应激反应（endoplasmic reticulum stress ERS）[3]可能参与其中，而GRP78蛋白是ERS的经典标志物。本研究旨在观察脓毒症大鼠GRP78蛋白的变化规律及与心肌损伤的关系，为ERS在脓毒症发病过程中的作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠35只，质量150～200 g，由大连医科大学实验动物中心提供。采用随机数字表法分为对照组（n=7）和模型组（n=28），其中，模型组按照内毒素注射时间不同再设2、6、12、24 h四个时相点，每组7只。

1.2 试剂 脂多糖（Sigma公司），兔抗大鼠GRP78多克隆抗体（Abcam公司），二步法抗兔免疫组化检测试剂盒（DAKO公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制备 采用内毒素腹腔攻击制备脓毒症大鼠模型。大鼠适应性饲养24 h后，腹腔注射脂多糖（LPS）1 mg/kg建立脓毒症大鼠模型，对照组大鼠予等剂量生理盐水腹腔注射[4]。

1.3.2 标本制备 到达观察终点后，各组大鼠均开胸心脏采血5 ml放入EP管中，以3000 r/min离心5 min，留取血清行心肌标志物检查。取左心室置10%福尔马林中固定6～8 h，常规石蜡包埋，制成3 μm切片行免疫组化检查。

1.3.3 心肌标志物检测 采用德国Beckman全自动生化分析仪检测血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）水平。

1.3.4 GRP78检测 采用二步免疫组化法。心肌石蜡切片制备完成后，常规脱蜡水化，热修复抗原后3% H2O2处理。GRP78一抗（1：1000）4 ℃过夜，HRP标记的二抗室温孵育25 min，DAB显色。以PBS代替一抗为阴性对照。常规封片，镜下观察。根据文献[6]进行阳性评分，评分方法分为4级：0分：无染色细胞或单个表达的细胞；1分：弱表达，阳性率10%～35%；2分：中度表达，阳性率35%～70%；3分：强表达，阳性率>70%。每张切片至少观察10个视野[5]。

1.3.5 心肌损害病理组织学评分 采用HE染色光镜下半定量评分，以10倍物镜下，随机选取若干视野观察整个左室心肌切面，从心肌变性坏死、出血、间质水肿和中性粒细胞浸润四方面观察心肌病变分布情况并计分，计算每种病变的视野比例（有心肌病变的视野数/镜下观察的总视野数），正常心肌计0分；病变灶性，病变视野比例≤1/4计1分；病变视野比例为1/4～1/2计2分；病变弥散性，病变视野比例≥1/2计3分。每方面的得分求和即为最后计分[6]。

1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，进行单因素方差分析和独立样本t检验以及直线相关分析。P

2 结果

2.1 心肌标志物变化 模型组大鼠2h血清CK-MB及cTnI与对照组比较无明显差异（P>0.05）。而6、12、24 h组血清CK-MB及cTnI均较对照组显著升高（P

表1 各组血清心肌标志物水平（x±s）

组别 CK-MB（U/L） cTnI（ng/ml）

对照组（n=7） 178±41.2 0.19±0.01

模型组 2 h（n=7） 185.2±46.5 0.22±0.03

6 h（n=7） 1042.5±133.5* 1.66±0.12*

12 h（n=7） 2408.7±382.5* 2.74±0.45*

24 h（n=7） 3511.7±892.4* 3.82±0.74*

*与对照组比较，P

2.2 心肌病理学改变 HE染色见对照组心肌细胞形态规则，横纹清楚；模型2 h组见心肌细胞轻度肿胀，横纹清楚，少量炎细胞浸润；6、12及24 h组心肌细胞及间质肿胀明显，横纹不清，较多的炎性细胞浸润；其中，24 h组有点状坏死灶形成。病理评分结果见表2。

2.3 心肌GRP78表达 阳性染色细胞呈棕黄色。模型组在2 h时即出现GRP78阳性细胞，并呈逐渐增多趋势，24 h最多。各时相点均较对照组有显著差异（P

2.4 GRP78水平与心肌损伤的关系 相关性分析表明，GRP78表达与心肌损伤具有显著正相关（r=0.711，P

表2 各组GRP78评分及心肌组织病理评分比较（x±s） 分

组别 GRP78评分 心肌组织病理评分

对照组（n=7） 0.31±0.01 0.03±0.00

模型组 2 h（n=7） 1.00±0.00* 0.99±0.01*

6 h（n=7） 1.33±0.52* 2.79±0.21*

12 h（n=7） 2.82±0.41* 5.44±0.26*

24 h（n=7） 5.32±0.49* 9.30±0.51*

*与对照组比较，P

3 讨论

严重感染、创伤及外科大手术等急性损伤常伴有过度炎症反应，可导致脓毒症，甚至脓毒症休克及多器官功能不全（MODS）。至今仍是临床危重症患者的主要死亡原因之一。多个动物实验及临床观察均证实脓毒症存在不同程度的心肌损伤[7-9]，而其机制尚未完全阐明。

内质网是真核细胞重要的细胞器，它在蛋白合成、翻译、折叠组装等方面发挥重要作用。近年来许多资料[5，8-9]证实，脓毒症可导致微循环障碍，组织缺氧、缺血-再灌注损伤，细胞内质网功能状态改变，结果之一即是激活未折叠蛋白（unfolded protein response，UPR），导致内质网应激（ERS）。ERS本身是真核细胞的一种保护性应激反应，其持续时间及水平对应激细胞的功能与生存具有重要影响[10-11]。

有研究报道，以严重烧伤复制的脓毒症大鼠模型中，存在心肌组织严重损伤，且损伤心肌组织存在ERS相关蛋白的过度表达[5]。另有多个报道心脏骤停诱导的缺血再灌注损伤可导致心肌细胞ERS，活化UPR，导致心肌细胞损伤[6，9]。此外，在腹膜炎脓毒症模型及菌血症模型中发现ERS参与脑组织及肾脏损伤的发生发展[12-13]。提示ERS在SIRS进展过程，特别是器官功能损伤中具有重要作用。

本研究采用持续小剂量内毒素攻击腹腔复制脓毒症大鼠模型，模型所表现出的血流动力学状态更接近于临床患者表现[4]。研究发现脓毒症早期即出现心肌损伤，并同时出现GRP78表达，而此时心肌标记物却并不敏感。此外，ERS程度与心肌损伤呈显著正相关，随脓毒症病程进展，损伤逐渐加重。此点与国内外相关研究结果一致。实验缺陷在于观察时间短，模型病生理进展远较临床凶险，ERS作用的信号转导通路仍不明确，以上问题均有待于进一步研究。综上，ERS在脓毒症所致的心肌损伤中发挥重要作用，其水平可较好的表现心肌细胞的功能状况。在脓毒症的发生发展中具有重要作用。

参考文献

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（收稿日期：2013-03-28） （本文编辑：李静）