结核患者的结核分枝杆菌检验和分型

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【摘要】 目的 探讨结核患者的结核分枝杆菌检验和分型。方法 采用琼脂糖凝胶的电泳和PCR技术， 选取200株结核分枝杆菌六个能够变化的重复点进行检测， 使用Version3.0及Gel-Proanalyzer3.0软件对检测的结果做一个基因型的分析， 同时分析结核分枝杆菌分型与基因间的关系。结果 这200株临床分离的株全部被鉴定是结核的分枝杆菌；VNTR显示结核杆菌株在不同的位点中具有多种形式的DNA指纹图谱。结论 应用分子检测法， 相比常规性方法， 它具有全信息化、可以重复以及操作简单等优点。

【关键词】 结核患者；Version3.0软件；基因分析；检验；分型

目前， 绝大多数肺结核患者就诊于各级综合性的医院， 怎样才能够有效地提高这些医院对诊治肺结核发现水平， 这已经成为我国医院所面临的一个非常迫切的事项， 只有提高了医院的肺结核的发现率，才能够有效地达到该病早期的治疗， 早康复， 减少该病的传染[1， 2]。对此， 本文立足结核分枝杆菌的检验和分型理论， 结核相关前沿性信息， 来探讨结核患者的结核分枝杆菌检验和分型。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取本院结核病防治部门从2010年11月-2012年11月间所接诊结核患者的200株结核分枝杆菌， 透过临床上对分离株实施有效的分析。

1. 2 方法 实验室应用的试剂。在对结核患者的结核分枝杆菌检验和分型时要应用GoldViewTMDNA染料、TaqDNA聚合酶以及dNTP， 准备PCR材料 [3]。

实验室所应用的仪器。这些实验仪器包括DNA的自动扩增仪、菌体培养箱、生物型的安全柜、恒压恒流的电泳仪以及凝胶成像的系统 [4]。

1. 3 统计学方法 在本文中， 笔者所采用的相关数据均用（x-±s） 表示， 同时使用SPSS10.0软件实施统计学处理， 同时为加强可信度， 本文中每组之间的数据的比较也使用t来进行检验， 文中的实验数据都为平均值。P

2 结果

2. 1 在对这200株结核分枝杆菌实施监测的结果。运用TCH与PNB对这些200株进行实验， 同时通过在菌体培养基中出现的问题对这些非结核性的分枝杆菌、结核的分枝杆菌进行详细的分析， 获得最终结果为：这200株临床分离株全部被鉴定为结核的分枝杆菌。

2. 2 在对这200株结核分枝杆菌进行VNTR的结果。在本院权威专家实施研究后， 作者进一步选择了10个基因点进行研究， 对这些结核杆菌实施相关性的检测， 同时用H37RV作了进一步的数据对照。在此实验中可知在同一位点的扩增片段中的大小是不一样的的， 结核杆菌株在不同的位点中具有多种形式的DNA指纹图谱。

2. 3 药敏性的结果。在药敏性的检测中， 发现如下结果：完全敏感的结核分枝杆菌有160株， 占到总数的80%；产生耐药性的结核分枝杆菌有40株， 占到总数的20%。

3 讨论

随着居民的物质生活水平得到显著提高， 各种疾病也开始侵蚀国民的身体， 结核病已成为一种常见传染性疾病， 它是一种慢性的呼吸道的传染病， 也是当前一个非常突出的一个公共卫生问题， 现今在我国， 有结核菌感染者有4亿人左右， 活动性肺结核病人有600万左右， 结核已经成为当前社会一种严重威胁人类身体健康的传染病。

如今， 生物工程发展迅速， 带动了相关医疗技术的进步， 临床上我们运用可变数目的串联重新分型技术可以有效的对结核患者的结核分支杆菌进行检验和分型， 相比常规性方法， 它具有全信息化、可以重复以及操作简单等优点。由于可以运用计算机进行分析， 可以大量的输入样本数据信息， 这样得到的数据比较可靠。

临床上， 除了应用分子技术进行检验外， 还有涂片法、分离培养法、快速结核分枝杆菌药敏试验等。

涂片法。涂片法一般让涂抹的面积保持均匀的涂膜厚度， 应用萋尼的染色抗酸进行染色，同时要求每一个涂片最小检测200个油镜视野。金胺石炭酸的染色法中的荧光染色最少要有检测的20个视野， 这种检测方法相比前一种方法的阳性的检出率高， 但在特异性上没有抗酸染色法优。

分离培养法。结核杆菌在培养基的培养方式常用的有几种：一是利用鸡蛋作为原料的培养基， 一般是运用罗氏的培养基。二是运用琼脂作为原料的培养基。三是选择性的培养基， 它可以与一些非选择性的培养基一起应用， 选择性的培养基的L-JGrugt 含有奈丁酸、青霉素， 同时培养基中包括林可霉素、放线酮及綦啶酸。四是液体培养基。

快速结核的分枝杆菌药敏性试验。操作方法一般在选用的结核杆菌的培养基中加进一些利福平药物、荧光指示剂以及异烟肼药物。培养基中的荧光一般在有氧的情形下会淬灭， 一旦细菌存活下来实施代谢活动， 就会消耗培养基中的氧气， 荧光又会复发。应用365的紫外线灯下有没有荧光来判断耐药或者敏感。这是由于荧虫酶的基因进入培养基中的结核杆菌的嗜菌体， 嗜菌体在侵染存活的结核杆菌就会发出荧光。这些菌体在于一定浓度的药物相互作用后， 如果这些菌体存活下来就会侵染嗜菌体， 观测到有荧光的就是耐药， 没有荧光的就是敏感菌。

在一般分型中， 用RFLP技术实施结核菌的分型。临床上， 运用结核的分支杆菌序列IS6100的片段作为探针， 这样就能够运用结核杆菌DNA实施鉴定、分型， IS6100的片段一般仅存在结核分支杆菌中的复合基因组， 利用PVU-Ⅱ进行切割， 并用245BP的探针实施杂交， 这样就能够出现9～24条带，能够用在流行病学的分析， 例如在菌株， 结核分枝杆菌的标准菌株是H37RV和减毒性的结核分枝杆菌是H37RA。测定菌株经改良锣氏培养基培养， 并鉴定为结核分枝杆菌。

对于结核病的管理工作也是一项非常重大环节， 在以上的预防措施的基础上， 建立有效完善的可疑的肺结核者相关处理指引和报告制度。医护人员一旦发现可疑的肺结核者后， 就需要进行正确有效地进行现场隔离可疑的肺结核者的这些紧急的操作措施， 在依据可疑的肺结核者的具体情况决定采取何种药物、治疗干预措施。在此基础上， 做好相关报告、登记程序， 并对肺结核患者身体状况进行追踪工作。

参考文献

[1] 蒋毅，张丽水，赵秀芹， 等. MLVA技术用于福建105株结核分枝杆菌基因分型的初步研究. 中国共患病学报. 2007， 17（03）：173-175.

[2] 吴长东，米利古，龚天美， 等. RD105缺失基因检测法用于结核分枝杆菌新疆“北京家族”临床分离株的鉴定. 中国病原生物学杂志. 2010，15（03）：183-184.

[3] Borna Muller，Lin-Mari de Klerk-Lorist，Marijke M. Henton， et al.Mixed infections of Corynebacterium pseudotuberculosis and non-tuberculous mycobacteria in South African antelopes presenting with tuberculosis-like lesions. Veterinary Microbiology . 2011，15（06）：73-75.

[4] D.J. Stewart，J.A. Vaughan，P.L. Stiles，et al.A long-term bacteriological and immunological study in Holstein-Friesian cattle experimentally infected with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and necropsy culture results for Holstein-Friesian cattle， Merino sheep and Angora goats. Veterinary Microbiology . 2007，18（02）：283-284.