银杏叶提取物对大鼠局灶性脑缺血后血管新生的影响

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[摘要] 目的 探讨银杏叶提取物是否可以促进大鼠局灶性脑缺血后梗死周围区的血管新生，寻求促使脑缺血后血管新生、开发脑储备能力的有潜力的中医药疗法。 方法 采用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，术后24h采用银杏叶注射液以10mg/（kg体重・d）的剂量连续腹腔注射治疗6d，于缺血后第7 d、14 天分别观察银杏叶组和对照组大鼠脑梗死体积、脑梗死灶周围血管密度（层粘连蛋白，Laminin的表达）和神经功能缺失评分的变化。 结果 与对照组比较，大鼠局灶性脑缺血后第7天和14 天银杏叶组的梗死体积明显减小，梗死周围血管密度较对照组明显增加，并显示出更好的神经功能评分（P

[关键词] 银杏叶提取物；脑缺血；血管新生

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）20-13-03

为探讨银杏叶提取物（Ginkgo biloba extracts，EGb）是否可以促进大鼠局灶性脑缺血后梗死周围区的血管新生，寻求促使脑缺血后血管新生、开发脑储备能力的有潜力的中医药疗法进行本研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

成年健康雄性Wistar大鼠40只，体重180～240g（广州医学院实验动物中心提供）。随机将大鼠分为银杏叶组和对照组（各20只）各组又再分为脑缺血后7 d、14 d两个时间点（各10只）。

1.2 大脑中动脉闭塞（MCAO）模型的建立

参照Zea Longa等[1]的线栓法略作改进。线栓采用直径为0.20～0.24mm的尼龙栓线（北京沙东生物技术有限公司），头端覆以硅酮（OV-101，上海化学试剂站进口分装）。

用6%水合氯醛腹腔注射（300mg/kg）麻醉，大鼠仰卧固定于手术台上，取颈部正中切口，分离出左侧颈总、颈内和颈外动脉，结扎左侧颈总、颈外动脉及其分支，于颈总动脉分叉处插入栓线约18～20mm至大脑前动脉近端，完全阻断大脑中动脉的血供来源，随后以手术缝线固定栓线和颈内动脉。

1.3 给药方法

银杏叶组：按动物体表面积剂量换算法，根据公式Db=Da×Rab（Db为所求剂量，Da为已知剂量，Rab为相应动物体表面积换算系数。以60kg成人每日注射87.5 mg 药物与200g大鼠体表面积换算比值换算出大鼠1d用量为10mg/kg体重，以此作为银杏叶注射液（金纳多注射液，德国威玛舒培博士药厂，含银杏叶提取物17.5mg/支）的治疗剂量。MCAO术后24h第1次腹腔注射给药，1次/d，连续治疗6d。对照组：以等量生理盐水腹腔注射。

1.4 神经功能评分

由不知道试验分组的研究人用Bederson评分标准[2]进行神经功能评价。离地面20cm处悬挂大鼠尾巴。前肢对着地面的正常反应被评为0分。右肢向着身体弯曲和（或）右肩旋转和肢体平分为不正常姿势。当大鼠有不正常姿势时，将其放置在一张软的塑料纸上，大鼠可能用爪抓住塑料纸。为了使前肢滑动，从双肩后面轻轻地给侧面压力，先右边后左边。如果两个方向的侧面压力都有抗性被评为1分，左边的侧面压力抗性减少被评为2分。自发逆时针转圈或左侧歪斜/不动评为3分。

1.5 脑梗死体积采用TTC 染色法

MCAO术后第7天 、14天各组随机取5只大鼠，麻醉后快速断头，用生理盐水冲净血液，取出脑组织，放入-20℃冰箱10min，取出后，从视交叉开始，向前切取1 片，向后切取4 片2mm 厚的切片，共5片，放入1% TTC（2，3，5-三苯基氯化四氮唑，国药集团化学试剂有限公司）溶液中，严格避光，37℃恒温孵育30min，15min时翻面，后移置10%甲醛中固定3h，无染色区为梗死组织，切片照相。

1.6 组织学标本采集

到时间点前麻醉大鼠（方法同前）后固定于手术台上，到时间点即予PBS（0.01M，pH 7.4）心脏灌注5min处死，接着予4%多聚甲醛PBS行心脏灌注前固定20～30min，取脑后冠状切取前囟前1mm至前囟后2mm的脑组织，浸泡于相同浓度的多聚甲醛4℃过夜作后固定。标本采用切片机（VT 1000S，Leica，Nussloch，Germany）行连续冠状切片（片厚40μm），相邻切片分为2套，分别用于免疫组化染色和HE染色。

1.7 免疫组织化学染色

切片予PBS充分漂洗（每次5min，共3次），0.3%过氧化氢PBS摇床上孵育30min；充分漂洗后于含10%羊血清、0.1% Triton X-100的PBS中孵育1 h以阻断非特异性结合；加入兔抗laminin 多克隆抗体（1∶200，Sigma-Aldrich），稀释液为含10%羊血清、0.1% Triton X-100的PBS，4℃孵育过夜；充分漂洗后加入生物素标记羊抗兔二抗（1∶200； Vector Laboratories），稀释液为含10%羊血清的PBS，室温孵育2h；充分漂洗后加入亲和素-生物素复合物中室温孵育1h；反应产物用DAB显色，自来水充分冲洗；脱水、透明后封片。

1.8 图像分析和统计学处理

梗死体积用TTC无染色区与对侧大脑半球百分比表示；毛细血管密度用laminin免疫阳性百分比表示，梗死灶周围皮层（850μm×640μm）图片在20倍的物镜下，随机选 3个视野，每个视野间距200μm，结果用3个视野的平均数表示。图像分析用NIH Image J 1.38程序。所有数据以（）表示，应用StatView5.0软件进行统计学分析。组间比较采用t检验（unpaired t-test），P

2 结果

2.1 梗死灶体积

TTC染色显示在所有缺血大鼠中，大脑皮层梗死灶局限在左颞顶皮层及其皮质下区。在MCAO术后7 d和14 d，银杏叶组较对照组的梗死体积明显减小，7d：（16.70±1.23）% vs （21.00±1.31）%；14 d：（12.80±1.47）% vs （17.30±1.35）%。见表1。

2.2 梗死灶周围的血管新生

Laminin（层粘连蛋白）是血管基膜的标志。缺血后银杏叶组laminin免疫反应性逐渐增加，缺血后第7天、14天皮层梗死灶周围的血管密度较对照组显著增加。见图1。

MACO术后7d和14 d，梗死周围皮层血管密度比较，银杏叶组比对照组明显增加，缺血后7d：（12.00±1.14）% vs （8.22±0.47）%，t=3.063，P=0.0155；14d：（10.28±0.62）% vs （7.16±0.41）%， t=4.196，P=0.003。

2.3 神经功能评分

与对照组比较，卒中发生后7d和14d银杏叶组显示更好的神经功能评分，缺血后7d：（1.60±0.16） vs （2.50±0.17），14d：（0.50±0.17） vs （1.50±0.17）。见表2。

3 讨论

近年来，我国的脑卒中发病率呈明显上升趋势，其中缺血性卒中占脑卒中的60%～80%。在缺血性脑卒中的治疗方面，人们越来越多地把目光投向了人体内源性的脑储备能力。其中，侧支循环储备中的血管新生能力因具有无限的潜力成为研究者关注的焦点。1994年，Krupinski等[3]对10例存活5～92d的脑梗死患者的脑组织切片进行研究，证实了缺血脑组织中微血管密度增加，且在卒中后7d即出现，其模式与正常脑组织的血管网非常相似。2006年美国的一项观察MCAO后募集骨髓干细胞的研究进一步证实，缺血侧会出现血管新生[4]。既然人体自身存在代偿性的血管新生以改善缺血区的供血，人们便试图给予外源性刺激激发人体的这一功能，治疗性血管新生（therapeutic angiogenesis，TAG）即应运而生。目前在心肌缺血和其他外周缺血性疾病中，治疗性血管新生已进入临床试验阶段甚至临床应用阶段。由于缺血性脑卒中的特殊性，目前治疗性血管新生还仅处于动物实验阶段。目前，治疗性血管新生的研究主要集中在对血管生成因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）等的应用上。但由于血管生成因子自身成分或基因治疗中某些载体成分的安全性问题，血管生成因子的应用还存在一定的风险：在诱导血管性新生的过程中可能促进肿瘤的生长；VEGF可能会引起糖尿病视网膜病变患者的视力衰退；病毒载体具有毒性及会引起炎症性免疫反应等。为了避免这些风险，科学家们想到了另外的途径，就是通过给予刺激或药物促进血管生成因子的产生。已有研究发现他汀类药物可显著提高内源性VEGF水平，并增加循环中血管内皮祖细胞的数量而促进血管生成[5]。但其在急性卒中的疗效和安全性尚未得到证实。而祖国传统医学――中医药由于具有良好的安全性而成为治疗性血管新生研究中的热点。

银杏叶提取物是从银杏叶中分离纯化的提取物，因其作用范围广且不良反应少而在缺血性心脑血管病的治疗中得到广泛应用。EGb中的有效成分主要是黄酮苷类和萜类，它具有众多的药理作用：清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应、拮抗血小板活化因子（PAF）、调节血管活性和增加血流量、降脂等。研究表明，脑缺血后EGb可以通过减轻线粒体功能衰竭、降低谷氨酸等毒性物质的释放、减少继发性神经细胞死亡/凋亡等机制起神经保护作用，同时还有助于脑血流的恢复和减轻脑水肿[6-9]。但目前尚未见到有EGb应用于脑缺血后治疗性血管新生的研究。关于银杏叶提取物与血管生成的关系，自1994年起已逐渐发现并证明EGb可以抑制血管生成、用于肿瘤的治疗[10]。这是否意味着EGb不能用于促进血管新生呢？随着脑缺血后治疗性血管新生研究和中医络病理论的发展，人们提出了疑问：既然中药可以抑制肿瘤性的血管生成，那么在不同的病理状态，如脑缺血后可否用于促进血管的生成？中医络病理论认为，血管生成亢进的肿瘤和血管生成不足的缺血性疾病与中医络病的络脉亢进和络脉虚滞的理论相一致，通畅络脉是络病的治疗总则，对于络脉生成亢进，要在通络的基础上，抑制络脉亢进，而对于络脉生成不足，则要在通络的基础上，促进络脉的生成。祖国医学认为EGb具有补气养血的功效，因而具有通络作用。既往研究发现其可增加脑缺血后血流量可能亦与其促血管新生有关。已有研究发现EGb可显著增加外周血内皮祖细胞的数量及改善其粘附、增殖和体外血管生成能力[11]。我们前期的研究也发现，EGb对同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1（LOX-1） mRNA表达升高有较强的拮抗作用，减轻其所致的内皮细胞损伤[12]。因此，根据EGb的多种药理活性，我们推测EGb是一个极具潜力的、有望应用于治疗性血管新生的中药。本研究发现，脑缺血后经银杏叶提取物治疗后梗死周围皮层的血管密度明显增加，并显示出更好的神经功能恢复，提示银杏叶提取物可能通过促进局灶性脑缺血后大鼠脑梗死周围区的血管新生，从而开发脑储备能力，这可能是银杏叶提取物改善脑缺血后神经功能恢复的机制之一，银杏叶提取物有望应用于脑缺血后的治疗性血管新生。

[参考文献]

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[12] 梁燕玲，许治强，匡永锋，等.银杏叶提取物对同型半胱氨酸诱导LOX-1 mRNA表达升高的拮抗作用[J].广东医学，2008，29（1）：53-55.

（收稿日期：2013-09-22）