艾烟对快速老化模型小鼠脑内氨基酸类神经递质含量的影响

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摘要：目的 观察艾烟对快速老化模型小鼠（SAMP8）脑内氨基酸类神经递质的影响，探讨艾烟的抗衰老作用效应及机制。方法 将70只SAMP8随机分为模型组和6个艾烟干预组。另外选取10只正常老化小鼠（SAMR1）作为正常组。艾烟干预分为低、中、高3个浓度，干预时间分别为15 min和30 min，每日干预1次，共28 d。采用高效液相色谱法测定各组小鼠脑内谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、γ-氨基丁酸（GABA）含量。结果 模型组小鼠脑内Asp和Glu含量高于正常组，GABA低于正常组。艾烟干预各组小鼠脑内Asp和Glu含量均低于模型组，GABA含量高于模型组，或与模型组相当。不同浓度、时间艾烟干预对Asp和Glu的影响无差异。中浓度30 min的艾烟干预可最大程度提高SAMP8脑内GABA。结论 艾烟干预可降低SAMP8脑内过高的Glu、Asp含量，升高过低的GABA含量，通过调整脑内氨基酸的异常代谢达到抗衰老的效应。

关键词：艾灸；艾烟；氨基酸类神经递质；抗衰老；小鼠

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）10-0029-03

艾灸疗法是中医学主要疗法之一，应用范围十分广泛。保健强壮、养生延年是艾灸的主要作用之一。研究表明艾灸可通过提高免疫、调整内分泌、改善代谢等途径达到抗衰老的效应[1-3]。艾灸作用除温热刺激、光、辐射等物理效应外，还存在艾燃烧生成物（即艾烟）的药用化学作用[4]。目前对于艾灸机制研究多数集中于温热效应，对艾烟的效应研究尚不充分。

本实验选用快速老化模型小鼠（SAMP8）作为干预对象，通过观察艾烟对SAMP8脑内氨基酸类神经递质含量的影响，探讨艾烟抗衰老的作用效应，以期为艾灸疗法的作用机理研究提供参考。同时，实验采用2×3析因设计，比较不同浓度及不同时间的艾烟干预下SAMP8脑内氨基酸类神经递质含量，探讨艾烟干预的适宜参数。

1 实验材料

1.1 动物

本实验选用清洁级6月龄雄性SAM小鼠80只，购自天津中医药大学第一附属医院动物中心，许可证号：SCXK（津） 2008-0001。其中SAMP8 70只，同品系正常老化小鼠（SAMR1）10只，体质量（30±2.7）g。所有小鼠均采用标准动物饲料喂养，自由进水；饲养环境温度为（22±2）℃，湿度保持在50%～60%。采用人工控制室内照明，保持12 h光照（8：00～20：00）和黑暗（20：00～次日8：00）交替循环。

1.2 主要仪器与试剂

特制细艾条（φ0.5 cm×20 cm，河南南阳汉医艾绒有限公司）；小鼠固定笼（自制，圆柱形，底面直径5 cm，高10 cm）；带孔玻璃缸（自制，80 cm×80 cm×60 cm，顶层玻璃正中设有直径为5 mm的圆孔；光散射式数字粉尘测试仪（北京宾达绿创科技有限公司）。谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、γ-氨基丁酸（GABA）标准品，均由国药集团化学试剂有限公司生产。

2 实验方法

2.1 分组

小鼠适应性饲养1周后，10只SAMR1为正常组，70只SAMP8按随机数字表法分为模型组和6个艾烟干预组。采用2×3析因设计，艾烟干预浓度分别为低浓度（5～15 mg/m3）、中浓度（25～35 mg/m3）和高浓度（85～95 mg/m3），干预时间为15 min和30 min两个水平。6个艾烟干预组分别为低浓度15 min组、低浓度30 min组、中浓度15 min组、中浓度30 min组、高浓度15 min组、高浓度30 min组。

2.2 艾烟干预

将艾烟干预各组小鼠每日暴露于艾烟中，共4周。空白干预：空白干预包括正常组与模型组小鼠。分别用自制小鼠固定笼固定后放入玻璃缸内，不做其他处理，30 min后取出。①低浓度干预：将调试好的粉尘测试仪置于玻璃缸中间，将小鼠用自制小鼠固定笼固定后放于玻璃缸内。点燃细艾条，从玻璃缸上方圆孔中将燃烧的一端插入，令艾烟充满玻璃缸。用粉尘测试仪测试其浓度达到预定范围后（此过程艾条燃烧约15 s），将艾条取出，迅速封闭圆孔。此后每隔3 min记录1次浓度数值，使数值保持在10 mg/m3左右。若数值高于15 mg/m3，可将上方玻璃盖稍微移动，令艾烟散去部分后迅速将盖子移回；若数值低于5 mg/m3，可再将点燃的艾条由圆孔插入，以补充艾烟。②中浓度干预：艾条在玻璃缸内的燃烧时间延长至32 s，以使浓度数值保持在30 mg/m3左右。方法同低浓度组。③高浓度干预：艾条在玻璃缸内的燃烧时间延长至82 s，并使浓度数值保持在90 mg/m3左右。方法同低浓度组。

每次艾烟干预结束后，打开玻璃缸释放艾烟，并擦拭玻璃缸清除艾燃烧残留物，以便下次实验操作。

2.3 取材

在干预4周后，所有小鼠处死后，冰台上快速取脑。将取得的脑组织放入标记的冻存管中，液氮冻存数分钟后移入-70 ℃冰箱待检。

2.4 指标检测

邻苯二甲酚（OPA）柱前衍生反相高效液相色谱法检测脑组织Glu、Asp、GABA的含量。采用岛津LC-10ATVP系列高效液相色谱仪，配LC-10ATVP高压泵和自动进样器，RF-10AXL荧光检测器和岛津色谱工作站。流动相A：0.01 mol/L磷酸盐缓冲液-甲醇[65∶35（V/V）]；流动相B：0.01 mol/L磷酸盐缓冲液-甲醇[10∶90（V/V）]。梯度洗脱顺序：0～13.50 min，0%～30%B；13.51～20.00 min，80%B；20.01～30.00 min，0%B。流速：1 mL/min；进样量：20 nL。荧光检测器波长：激发波长（Ex）=357 ran；发射波长（Em）=455 nm。

3 统计学方法

采用SAS8.2统计软件进行分析。数据以―x±s表示。组间比较采用方差分析，组间多重比较采用SNK检验，艾烟干预各组之间比较采用析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

4 结果

4.1 艾烟对小鼠脑氨基酸类神经递质含量的影响

与正常组比较，模型组脑内Asp和Glu含量均高于正常组，GABA含量低于正常组，差异有统计学意义。艾烟干预各组脑内氨基酸水平介于模型组和正常组之间。与模型组比较，艾烟干预各组脑内Asp和Glu的含量均低于模型组，中浓度30 min组、高浓度15 min组小鼠脑内Asp含量与模型组差异有统计学意义，低浓度30 min组、中浓度15 min组、中浓度30 min组、高浓度15 min组小鼠脑内Glu含量与模型组差异有统计学意义。艾烟干预6组间脑内Asp和Glu的含量差异均无统计学意义。艾烟干预各组脑GABA含量除高浓度15 min组与模型组无显著差异外，其余5组均显著高于模型组。艾烟干预各组间GABA含量存在显著差异（见表1）。

4.2 艾烟干预各组小鼠脑γ-氨基丁酸析因设计的方差分析

时间因素有意义，艾烟干预15 min与30 min对脑内GABA含量的改变程度不同；浓度因素有意义，不同浓度艾烟干预可引起不同程度的脑内GABA改变。时间和浓度两种干预因素间不存在交互作用。结合均数比较可知，艾烟干预30 min的效果优于15 min；脑GABA含量呈中浓度>低浓度>高浓度的趋势。提示对提高脑GABA而言，中浓度30 min艾烟干预，可能是最佳干预剂量（见表2）。

5 讨论

SAMP8是由日本京都大学Takeda教授历经多年精心培育而成的近交系衰老模型小鼠，包括快速老化和抗快速老化亚系两种品系。不同亚系小鼠具有不同的病理表现型，其与衰老相关的病理改变与许多人类老年性疾病的病理改变相似。SAMP8主要表现为以学习记忆力障碍为特征的快速老化自然发生，已被广泛应用于研究快速学习记忆缺陷的发病机制，以及评价抗衰老及改善学习记忆功能的药物等[5-6]，是目前比较理想的自然衰老模型。SAMR1表现为正常老化，常用作SAMP8的对照。

脑内氨基酸类神经递质的异常是学习记忆障碍的原因之一。学习记忆的物质基础是脑内蛋白质的合成，而蛋白质合成的基础则是脑内氨基酸的合理组合和平衡。根据对神经元作用的不同，中枢神经系统内的氨基酸类神经质可分为兴奋性氨基酸（EAA）和抑制性氨基酸（IAA）两类。EAA参与突触兴奋传递，对大脑皮质具有强烈的兴奋作用，以Glu和Asp为代表，二者在学习记忆、神经元的生存、树突的生长与退化方面具有重要作用。正常情况下，Glu对学习记忆表现为正性调节作用，可通过激活NMDA受体，诱导长时程增强效应的形成。但Glu等兴奋性氨基酸在脑内的过多积聚又会产生神经毒性作用，大量的Glu释放可刺激N-甲基-D-天冬氨酸受体，产生膜的去极化，使钠、钙离子进入细胞内，导致线粒体损害、微丝蛋白分解、膜磷脂断裂、自由基形成、细胞水肿甚至细胞死亡[7-8]。

IAA以GABA为代表，对神经系统的神经元具有普遍抑制作用。有研究表明，衰老动物大鼠大脑皮质、海马、下丘脑抑制性氨基酸GABA的含量明显下降[9]。GABA具有降血压、增强记忆力、抗焦虑等作用[10]，又与脑衰老、的运动和类固醇激素的产生有密切的关系[11-12]。衰老时GABA含量的下降可进一步导致机体的抗氧化能力减弱，从而引发一系列的病理生理变化，最终导致神经元的损伤、凋亡，出现记忆力下降、认知障碍、思维迟缓等脑老化的表现。

本实验用不同浓度和时间的艾烟干预SAMP8，结果显示，模型组Glu和Asp的含量则高于正常组，而GABA的含量低于正常组，差异均有统计学意义。提示SAMP8小鼠脑内兴奋性氨基酸的过多积聚及抑制性氨基酸对其负性调节的降低导致的神经毒性作用是其衰老的原因之一。艾烟干预各组小鼠脑内Glu和Asp的含量均显著低于模型组，GABA含量显著高于模型组。说明艾烟可降低SAMP8脑内Glu和Asp含量，提高GABA水平。提示艾烟可通过中和、降低EAA过量对神经细胞造成的毒性作用和提高IAA含量以调节脑内氨基酸的异常代谢，改善脑神经细胞功能，延缓脑衰老。通过对GABA的析因分析中得出，时间和浓度因素对GABA的含量均有影响，艾烟干预30 min的效果优于15 min，中浓度的干预效果优于低浓度和高浓度。

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（收稿日期：2013-03-11，编辑：华强）