HPLC测定槐花药材不同部位芦丁和槲皮素含量
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摘要：目的 比较槐花不同部位（槐花、槐米及枝梗）中芦丁和槲皮素的含量。方法 采用高效液相色谱法进行测定，Ultimate XB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，0.45 ?m），水-甲醇为流动相梯度洗脱，流速1 mL/min，柱温35 ℃，检测波长256 nm，进样量20 ?L。结果 芦丁含量为槐米>槐花>枝梗；槲皮素含量整体较低，且槐花>槐米>枝梗。结论 槐花各部位芦丁含量较高，且含量差别不大。槐花中的槲皮素含量明显高于槐米及其枝梗。
关键词：槐花；不同部位；芦丁；槲皮素；含量比较
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.12.016
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）12-0043-03
Content Determination of Rutin and Quercetin in Different Parts of Sophora Japonica L. Medicinal Materials by hplc DU Yu-ran1， HE Fu-yuan1，2，3， ZHOU Yi-qun1， XIE Xiang-gui1， SHI Ji-lian1，2 （1.Department of Pharmaceutics， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；2.Property and Pharmacodynamic Key Laboratory of Chinese Matria Medica， State Administration of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；3.Pharmaceutical Preparation Technology and Evaluation Laboratory of Chinese Matria Medica， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）
Abstract：Objective To compare rutin and quercetin content of different parts （flower， bud and pedicel） of Sophora Japonica L.. Methods HPLC method was used with Ultimate XB-C18 column （4.6 mm×250 mm， 0.45 ?m）， water and methanol as solvent system with gradient elution. The flow rate was 1 mL/min， column temperature was 35 ℃， detection wavelength was set at 256 nm， and injection volume was 20 ?L. Results The content of rutin was bud>flower>pedicel. The content of quercetin was low on the whole， and in sequence of flower>bud>pedicel. Conclusion In the different parts of Sophora Japonica L.， rutin content is high with little difference. Quercetin content of flower is significantly higher than in bud and pedicel.
Key words：Sophora japonica；different parts；rutin；quercetin；comparison of content
槐花为豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花及花蕾，前者称“槐花”，后者称“槐米”，具有凉血止血、清肝泻火的功效[1]。现代研究表明，其黄酮类主要成分芦丁和槲皮素均具有多种药理作用[2]。近年来，随着医药工业的发展及保健品的开发，槐花作为黄酮类的提取原料，其需求量逐年递增。但因栽种局限性、生长半野生化及环保限制采收等原因使槐花产量减少[3]。市售槐花药材中除了槐花和槐米外，还含有大量的枝梗，在炮制过程中常常被作为非药用部位而除去[4]。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定、比较分析同一来源的槐花药材中的槐花、槐米及其枝梗所含芦丁及槲皮素的含量，探讨槐花同一来源不同部位有效成分的差异性，为槐花药材的净制加
基金项目：国家自然科学基金（81173558）；湖南省“十二五”重点学科中药学（1008）；湖南省“十二五”重点学科药学（1007）
通讯作者：石继连，Tel：0731-88458242，E-mail：hnsjl@163. com
工、资源利用及质量标准提供依据。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪（含1525工作泵及2487检测器）；Adventurer-AR1140型电子分析天平。芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号100080-200707），槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，批号100081-200907）；槐花药材购于湖南长沙高桥药材大市场，经湖南中医药大学周日宝教授鉴定为豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花、花蕾及其枝梗；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯；液相色谱用水为超纯水（自制，0.45 ?m滤膜滤过）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Ultimate XB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，0.45 ?m）；流动相：水-甲醇。梯度洗脱程序：甲醇0 min，20%；10 min，35%；25 min，50%；40 min，52%；45 min，20%。流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：256 nm；进样量：20 ?L。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取50 mg芦丁对照品及2.5 mg槲皮素对照品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至10 mL，摇匀，过0.45 ?m微孔滤膜，即得芦丁浓度为5.0 mg/mL、槲皮素浓度为0.25 mg/mL的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密称取净制后的槐花、槐米及其枝梗各5 g，分别置于圆底烧瓶中，加入20倍量水浸泡1 h，加热回流2 h，放冷，加水补足差失的量，过滤，分别吸取续滤液2 mL，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中定容，过0.45 ?m微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
2.4 线性关系考察
精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，分别置2 mL容量瓶中加甲醇定容，过0.45 ?m微孔滤膜，分别精密吸取续滤液20 ?L，注入液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件测定。以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标进行回归，得芦丁回归方程Y=616 879X-153 923，r=0.999 5，表明芦丁在0.00～50.0 ?g范围内与峰面积呈良好的线性关系；槲皮素回归方程Y=144 794X+54 780，r=0.999 8，表明槲皮素在0.00～2.50 ?g范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
取“2.2”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，测定芦丁的峰面积RSD=1.64%，槲皮素的峰面积RSD=1.60%，表明精密度良好。
2.6 重复性试验
精密称取同一来源的槐花共6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定。结果芦丁的平均含量为13.53%，RSD=0.26%（n=6）；槲皮素的平均含量为0.61%， RSD=2.06%（n=6）。
2.7 稳定性试验
取上述“2.3”项下制备的同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定色谱峰面积，结果芦丁和槲皮素的RSD分别为1.15%、1.27%，表明供试品溶液在24 h内性质较稳定。
2.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的同批槐花9份各0.5 g，置圆底烧瓶中，分别按含量的80%、100%、120%等3个水平各3份，精密加入芦丁对照品和槲皮素对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，芦丁和槲皮素的平均回收率分别为99.23%、99.61%，RSD分别为1.64%、1.75%（n=9），结果见表1。
2.9 含量测定
分别精密称取槐花药材不同部位各3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，各精密吸取供试品液20 ?L进样，按“2.1”项下色谱条件测定，色谱图见图1，计算芦丁和槲皮素的含量，结果见表2。
表1 加样回收率试验结果
成分 取样量
（g） 样品含
量（mg） 加入量
（mg） 测得量
（mg） 回收率
（%） 平均回
收率（%） RSD
（%）
芦丁 0.504 3 64.50 51.00 115.90 100.78
0.503 9 64.45 51.00 116.20 101.57
0.499 2 63.85 51.00 114.55 99.41
0.514 1 65.75 64.00 128.26 97.66
0.486 7 62.25 64.00 126.55 100.47 99.23 1.64
0.479 3 61.30 64.00 123.80 97.66
0.526 1 67.29 77.00 143.19 98.57
0.486 4 62.21 77.00 136.81 96.88
0.510 7 65.32 77.00 142.30 100.08
槲皮素 0.504 3 3.03 2.40 5.41 99.17
0.503 9 3.02 2.40 5.48 102.50
0.499 2 3.00 2.40 5.38 99.17
0.514 1 3.08 3.00 6.10 100.67
0.486 7 2.92 3.00 5.84 97.32 99.61 1.75
0.479 3 2.88 3.00 5.91 101.00
0.526 1 3.16 3.60 6.72 98.89
0.486 4 2.92 3.60 6.42 97.22
0.510 7 3.06 3.60 6.68 100.56
A B
C D
注：A.对照品；B.槐花；C.槐米；D.枝梗；1.芦丁；2.槲皮素
图1 槐花药材不同部位HPLC图
表2 槐花药材不同部位芦丁和槲皮素含量测定结果（%，n=3）
部位 芦丁 槲皮素
含量 平均值 RSD 含量 平均值 RSD
槐花 12.69 0.59
12.72 12.79 1.15 0.61 0.60 1.82
12.96 0.59
槐米 14.45 0.48
14.56 14.56 0.76 0.46 0.47 2.13
14.67 0.47
枝梗 11.13 0.17
10.71 10.87 2.09 0.16 0.17 2.91
10.77 0.17
3 讨论
分别对芦丁对照品溶液和槲皮素对照品溶液在200～400 nm进行光谱扫描，芦丁在256 nm处有最大吸收，槲皮素在360 nm处有最大吸收，对槐米提取液进行紫外检测，在258 nm处有最大吸收，综合选择测定波长为256 nm。本试验先后选择了甲醇-1%醋酸及甲醇-水等体系作为流动相进行预试，发现2种体系均能够将芦丁和槲皮素分开，达到理想的分离度，理论塔板数大于3 000，故选择对色谱柱损害更小的甲醇-水作为流动相。在本试验确定的梯度洗脱条件下，芦丁和槲皮素的色谱峰与其他成分的色谱峰，分离度均较高，且槐花、槐米及枝梗色谱图相似度比较高。
试验结果表明，槐米的不同部位有效成分含量不同，其中芦丁的含量槐米>槐花>枝梗，而槲皮素的含量槐花>槐米>枝梗。由试验结果可知，枝梗中也含有较高的芦丁，在槐花资源减产的情况下，医药工业以槐花为原料提取黄酮类药物时，可以考虑不除去枝梗，以合理利用资源。若进一步结合槐花、槐米及其枝梗的药效实验研究，可为槐花药材不同部位的临床应用和质量控制提供科学数据。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：333.
[2] 程秀民，尘学兰，高彦慧.RP-HPLC测定槐米中芦丁和槲皮素含量[J].中成药，2004，26（8）：680-682.
[3] 邢振杰.槐米减产已成定局 后市蕴藏无限商机[J].中国现代中药， 2010，12（8）：51.
[4] 龚千锋.中药炮制学[M].2版.北京：中国中医药出版社，2007：103.
（收稿日期：2012-05-24，编辑：陈静）