HPLC―荧光法测定大鼠血浆中4种蒽醌类成分及其药代动力学研究
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[摘要]建立大鼠灌服栀子大黄汤后血浆中芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的测定方法并考察4种蒽醌类成分在大鼠体内的药动学行为。采用hplc-荧光法测定大鼠血浆中4种蒽醌的血药浓度，血浆样品通过液液萃取法进行处理。Phecda C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相0.2%乙酸-甲醇，梯度洗脱，流速1.0 mL・min-1。激发和发射波长分别为430，525 nm，采用DAS 2.0软件对所得的血药浓度进行拟合，求算相应的药动学参数。结果显示4种蒽醌类成分均可被吸收进入体内。大鼠血浆中芦荟大黄素，大黄酸，大黄酚，大黄素甲醚的Cmax分别为（0.085±0.058），（3.772±1.152），（0.464±0.267），（0.028±0.008） mg・L-1；tmax分别为（1.042±0.510），（0.805±0.307），（1.167±0.283），（0.616±0.162） h；t1/2分别为（3.557±1.250），（6.879±1.126），（5.196±2.032），（4.337±1.816） h；AUC0-t分别为（0.504±0.130），（9.558±1.106），（2.545±1.554），（0.052±0.018） mg・h・L-1。该研究建立了一种专属性强，准确度高，灵敏度好的HPLC-荧光法，可适用于4种蒽醌成分的体内浓度测定。
[关键词]栀子大黄汤；蒽醌；HPLC-荧光法；药代动力学
栀子大黄汤最早记载于《金匮要略》，临床上用于治疗冠心病[1]，急性胰腺炎[2]，黄疸[3]。该方剂由栀子、大黄、枳实和淡豆豉4味药材组成。本课题组前期研究了该方剂的物质基础，及配伍变化对栀子中京尼平苷药动学的影响，定量测定了该方剂中9个特征性成分[4-6]。目前关于栀子大黄汤中蒽醌类成分的药动学研究未见报道。中药体系复杂，其药效可能是多种物质综合产生的结果。对中药的有效成分进行药代动力学研究，可以为中药发挥药效提供一定的科学解释[7-8]。蒽醌类成分因其具有广泛的药理活性被认为是大黄的有效成分[9]，主要包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚。本研究采用HPLC-荧光法测定大鼠血浆中芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚的浓度，首次阐明了大鼠灌服栀子大黄汤后血浆中4种蒽醌类成分的药动学特性，为进一步开展该复方的研究奠定基础。
1 材料
1.1 药品与试剂 栀子（批号20130301，产地江西），大黄（批号130322，产地甘肃），枳实（批号130318，产地江西），淡豆豉（批号130218，产地河南），均购于南京先声药店。经中国药科大学中药学院秦民坚教授鉴定，栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥果实；大黄为蓼科植物药用大黄Rheum officinale Baill的干燥根和根茎；枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果；淡豆豉为豆科植物大豆Glycinemax （L.）Merr.的成熟种子的发酵加工品。芦荟大黄素（批号13030701），大黄酸（批号13031210），大黄酚（批号13021803），大黄素甲醚（批号13022005），均购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度均大于98%。内标1，8-二羟基蒽醌（批号110829）购于中国食品药品检定研究院。甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司）；乙酸（分析纯，南京化学试剂有限公司）；水为娃哈哈纯净水，其他试剂为分析纯。
1.2 仪器 LC-10ATvp高效液相色谱仪（日本岛津公司），AnkeTGL-16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂），AB135-S电子天平（梅特勒-托利多），AEU-210电子天平（日本岛津公司），XW-80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂），高速多功能粉碎机（上海冰都电器有限公司），RE-52CS型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
1.3 动物 清洁级SD大鼠，雄性，体重（250±10） g，由南京青龙山动物中心提供，动物许可证号SCXK （浙） 2008-0033。饲养温度为20～25 ℃，饲养环境湿度为（45±10）%。
2 方法
2.1 栀子大黄汤（ZZDHD）的制备 取栀子9 g，大黄3 g，枳实12 g，淡豆豉24 g，粉碎，加10倍量水浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮30 min，4层纱布过滤；滤渣重复提取2次，合并3次滤液。滤液经旋转蒸发浓缩后制成ZZDHD冻干粉。栀子大黄汤中4种蒽醌的含量测定参考文献[6]。
2.2 灌胃及采血 称取ZZDHD冻干粉适量，用0.5%羧甲基纤维素钠配制成栀子大黄汤，生药质量浓度为1.8 g・mL-1，临用前搅拌均匀。灌胃体积为15 mL・kg-1。实验前禁食12 h，自由饮水。给药前采集大鼠的空白血浆，于给药后的0.083，0.167，0.33，0.5，0.75，1，2，4，6，8，12，24 h眼眶采集0.5 mL全血置于肝素化的EP管中。16 000 r・min-1离心10 min取上清，-20 ℃保存至分析。
2.3 血样前处理方法 取200 μL血浆至10 mL刻度离心管，加2 mol・L-1盐酸40 μL及20 μL内标溶液（2.575 mg・L-1），涡旋1 min，加1 mL乙酸乙酯，涡旋2 min，4 000 r・min-1离心10 min，用1 mL刻度吸量管吸0.75 mL乙酸乙酯层，40 ℃水浴条件下N2吹干，残渣用100 μL甲醇复溶，涡旋1 min，16 000 r・min-1离心10 min，取上清液20 μL进样分析。
2.4 溶液的配制 内标溶液：取1，8-二羟基蒽醌适量，精密称定，置25 mL量瓶，加甲醇溶解并稀释配制成107.3 mg・L-1的内标溶液，置于4 ℃备用。标准溶液：分别取芦荟大黄素，大黄酸，大黄酚，大黄素甲醚适量，精密称定，加甲醇溶解后分别制得各对照品储备液。质量浓度分别为96.80，97.00，94.20，93.40 mg・L-1，置于4 ℃备用。分别量取各对照品储备液适量，用甲醇稀释成系列标准溶液备用。
2.5 色谱条件 Phecda C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相0.2%乙酸（A）-甲醇（B），梯度洗脱，程序如下，60% B（0～11 min），57% B（11.5～17 min），71% B（17.5～31min），85% B（32～42 min），60% B（43～50 min）。柱温25 ℃，流速1.0 mL・min-1，激发、发射波长分别为430，525 nm。
3 结果
3.1 专属性考察 分别取空白血浆，加入芦荟大黄素，大黄酸，大黄酚，大黄素甲醚及内标的血浆，给药后的实际血浆样本按2.3项下操作，记录色谱图，见图1。结果显示血浆中的内源性物质不干扰测定，该方法专属性良好。
3.2 标准曲线及定量下限 取大鼠空白血浆7份，每份200 μL，分别加入芦荟大黄素，大黄酸，大黄酚，大黄素甲醚系列标准溶液，使得各蒽醌的血药浓度分别为芦荟大黄素9.68，24.2，48.4，121，242，605，1 210 μg・L-1；大黄酸38.8，97，194，485，970，2 425，4 850 μg・L-1；大黄酚9.408，23.52，47.04，117 6，235.2，588，117.6 μg・L-1；大黄素甲醚5.604，14.01，28.02，70.05，140.1，350.25，700.5 μg・L-1。按照2.3项下操作，进样分析。以血浆中待测物的质量浓度x为横坐标，待测物与内标物的峰面积之比y为纵坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归，得芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的回归方程分别为y=8.585 4x-0.039 5（R2=0.999 0），y=3.789 7x-0.004 3（R2=0.999 4），y=4.924x-0.039 7（R2=0.999 6），y=17.256x-0.155 6（R2=0.996 1）。芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚分别在9.68～1 210，38.8～4 850，9.408～1 176，5.604～700.5 μg・L-1线性关系良好。最低定量限分别为9.68，38.8，9.408，5.604 μg・L-1。
3.3 准确度及精密度考察 取大鼠空白血浆200 μL，按照3.2项下方法制备4种蒽醌的低中高浓度的QC样本，每个浓度平行制备6份。各蒽醌的低、中、高浓度分别为芦荟大黄素24.2，121，1 210 μg・L-1；大黄酸97，485，4 850 μg・L-1；大黄酚23.52，117.6，1 176 μg・L-1；大黄素甲醚14.01，70.05，700.5 μg・L-1。按照2.3项下操作，分别于1 d内和连续3 d进行测定，与标准工作曲线同时进行测定，将测得值代入当日的标准工作曲线计算QC样品的浓度，计算该方法的准确度及日内、日间精密度，见表1。结果均符合体内生物样本分析测定的要求。
3.4 提取回收率 分别制备芦荟大黄素，大黄酸，大黄酚，大黄素甲醚QC样本低中高3个浓度（同3.3）各6份样本，按照2.3项下操作，测得样品中被测物的色谱峰面积。与相应浓度的标准溶液中各蒽醌的色谱峰面积比较，计算各蒽醌的提取回收率。结果提取回收率分别为95.6%，92.3%，75.8%，73.0%，均符合药动学研究的要求。
3.5 稳定性考察 制备低、中、高质量浓度的含芦荟大黄素（24.2，121，1 210 μg・L-1）、大黄酸（97，485，4 850 μg・L-1）、大黄酚（23.52，117.6，1 176 μg・L-1）及大黄素甲醚（23.52，117.6，1 176 μg・L-1）的血浆样品，按照2.3项下操作，分别考察血浆样品在4 ℃进样器放置12 h，-20 ℃放置3 d及反复冻融3次的稳定性。3种条件下，芦荟大黄素、大黄酸，大黄酚，大黄素甲醚的准确度介于89.9%～107.2%，RSD分别低于4.9%，5.4%，4.9%。表明样品在上述3种条件下均稳定。
3.6 栀子大黄汤中4种蒽醌的含量及给药剂量的计算 根据2.1项下的方法，计算出栀子大黄汤中芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的含量分别为0.026，0.112，0.055，0.028 mg・g-1。芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的灌胃剂量为0.702，3.024，1.485，0.756 mg・kg-1。
3.7 数据分析及结果 采用DAS 2.0软件（中国药理学会编制）中的非房室模型进行拟合并得到主要药动学参数。芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的Cmax分别为（0.085±0.058）， （3.772±1.152）， （0.464±0.267）， （0.028±0.008） mg・L-1，AUC0-∞分别为（0.536±0.117）， （9.701±1.007）， （2.690±1.546）， （0.067±0.012） mg・h・L-1。主要药动学参数见表2，药时曲线见图2。
4 讨论
蒽醌类成分具有共轭双键，能够吸收能量并以光的形式释放能量，从而产生荧光[10]，故本实验采用荧光检测法。在对色谱条件进行优化时，考虑到蒽醌类成分含有酸性基团，在流动相中加入乙酸，可有效抑制这些化合物的解离，改善峰形，同时考虑对柱子的保护作用，最终选择水相为0.2%乙酸。在所建立的色谱条件下，各物质分离良好。
根据预实验结果，经沉淀蛋白处理的空白血浆干扰大，而液液萃取处理后的空白血浆干扰小。故本实验血样前处理方法采用液液萃取法。分别比较乙醚，乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷不同萃取剂的提取回收率，其中乙醚和乙酸乙酯的提取回收率较后两者高。鉴于乙醚在操作过程中的可控性差，最后选择乙酸乙酯作为提取剂。由于待测物具有一定酸性，考虑对血浆进行酸化，使得大部分药物以非电离形式存在从而更易溶于提取剂中以增大提取回收率。
药代动力学研究结果显示，大鼠灌服栀子大黄汤后，4种蒽醌类成分均能被吸收入血。大黄酸和大黄素甲醚的达峰时间为36，48 min，而芦荟大黄素和大黄酚分别在1.042，1.167 h达峰，说明前两者比后两者入血快。4种蒽醌类成分中，大黄酸的Cmax和AUC最大，一般而言，药物的药峰浓度和被吸收程度与其在体内发挥疗效有一定关系。据文献报道[11-12]，大黄酸具有保肝活性，提示当栀子大黄汤用于防治酒精性肝损伤时，大黄酸有可能是主要的药效成分之一。芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的t1/2分别为3.557，6.879，5.196，4.337 h，其中大黄酸消除最慢，提示可能是药效维持的有效成分。
有文献报道[13]，大鼠灌胃柴芩承气汤（含大黄的中药复方）后，在其血浆中能检测到芦荟大黄素，大黄酸，大黄酚，大黄素及大黄素甲醚5种蒽醌类成分。但本实验却只能检测到4种蒽醌类成分。有研究表明，大黄素进入体内后在葡萄糖醛酸转移酶的作用下被迅速代谢为大黄素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸酐[14-16]，而本实验的测定对象是蒽醌类成分的游离形式，加之栀子大黄汤中大黄素的含量较低，推测是这两方面因素共同导致血浆中大黄素的量低于其最低定量限以至于未被检测到。
中药复方药代动力学是药代动力学的延伸与拓展，研究复方药动学有助于揭示方剂中隐藏的配伍规律以及复方的药效物质基础，对中药的现代化有重要意义。本文所建立的HPLC-荧光法成功应用于大鼠血浆中蒽醌类成分的药代动力学研究，为揭示中药复方配伍规律和指导临床合理用药提供理论依据。
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Simultaneous determination of four anthraquinones in rat plasma by
HPLC-FLD method and its pharmacokinetic study
HUANG Jin-qiu1， YAN Xue-mei1， FENG Fang1，2*
（1.Department of Pharmaceutical Analysis， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China；
2. Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance， Ministry of Education， China Pharmaceutical
University， Nanjing 210009， China）
[Abstract] This paper aims to develop a method for the determination of aloe-emodin， rhein， chrysophanol and physcion and study the pharmacokinetic properties of four anthraquinones in rat plasma after oral administration of gardenia and rhubarb decoction. The plasma concentrations at different time points of four anthraquinones were determined by HPLC-FLD method. Plasma samples were extracted with liquid-liquid extraction procedure. Plasma samples were separated on a C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 μm）， using 0.2% acetic acid and methanol as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL min-1 with gradient elution. The excitation and emission wavelengths were set at 430， 525 nm， respectively. DAS 2.0 software was applied to calculate the pharmacokinetic parameters. The results showed four anthraquinones can be absorbed. The main parameters of aloe-emodin， rhein， chrysophanol and physcion were as follows： Cmax for aloe-emodin was （0.085±0.058）， （3.772±1.152）， （0.464±0.267）， （0.028±0.008） mg・L-1 respectively； tmax for rhein was （1.042±0.510）， （0.805±0.307）， （1.167±0.283）， （0.616±0.162） h respectively； t1/2 for chrysophanol was （3.557±1.250）， （6.879±1.126）， （5.196±2.032）， （4.337±1.816） h； AUC0-t for physcion was （0.504±0.130）， （9.558±1.106）， （2.545±1.554）， （0.052±0.018） mg・h・L-1. This paper developed a selective， accurate and sensitive HPLC-FLD method for the simultaneous determination of four anthraquiones in rat plasma.
[Key words] Zhizi Dahuang decoction； anthraquinones； HPLC-FLD； pharmacokinetics
doi：10.4268/cjcmm20141937