DNA修复基因XRCC1单核苷酸多态与辐射损伤易感性相关性研究
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摘要： ［目的］ 研究dna修复基因xrcc1多态性与辐射损伤易感性的关系。 ［方法］ 采用1:1配对病例-对照设计，在对唐山市放射人员体检基础上，以113名出现染色体畸变的射线工作人员为病例组，按性别、年龄（±5岁）、民族、工种配对，选择与病例在同一工作岗位、工龄相近、累积受照剂量相同或相近且无辐射损伤的放射人员为对照组（113名）。以多聚酶链反应-限制性长度多态性分析技术（PCR-RFLP）检测XRCC1基因，比较不同基因型与辐射损伤易感性的关系。 ［结果］ 26304位点病例组和对照组同时携带CT/TT基因型的有23对，病例组携带CT/TT基因型而对照组携带CC基因型的有37对，病例组携带CC基因型而对照组携带CT/TT基因型的有20对，两组同时携带CC基因型的有33对，χ2检验显示两组间分布差异有显著性（P=0.0243），携带26304CT/TT基因型的射线暴露者发生染色体损伤的风险是携带其他基因型个体的1.85倍（95%CI 1.08～3.16）。XRCC1 G27466A位点和G28152A位点的各基因型频率在两组中的分布差异无显著性（P>0.05）。XRCC1 26304T等位基因频率病例组（35.84%）高于对照组（22.57%），差异有显著性（P=0.002）；XRCC1 G27466A位点和G28152A位点的各等位基因频率在两组间的分布差异均无显著性（P>0.05）。 ［结论］ XRCC1 C26304T基因多态性与辐射致染色体畸变有关联。未发现XRCC1 G27466A和G28152A基因多态性与辐射致染色体畸变有关。
文章编号:1006-3617(2007)01-0036-04
中图分类号:R114
文献标识码:A
随着科学技术的发展，X射线、γ射线、β射线等广泛应用于医学检查、治疗、工业探伤、食品处理等领域，接触射线的工作人员越来越多。电离辐射作用于机体，可使生物大分子发生激发和电离，导致多种生物学效应。但是射线工作人员对电离辐射的反应有较大差异，在相同的暴露情况下，有人染色体损伤明显，有人却不发生损伤。可见个体易感因素在辐射损伤发生中的作用不可忽视。人类X线交叉互补修复基因1（X-ray repair cross-complementing gene1，XRCC1）是一种重要的DNA修复基因，在辐射损伤过程中发挥重要作用。目前报道XRCC1基因主要存在3个多态性位点，这些位点发生突变后，可以导致其编码的蛋白质相应氨基酸改变，它们分别是第六外显子上C26304T（Arg194Trp）、第九外显子上G27466A（Arg280His）、第十外显子上G28152A（Arg399Gln）［1］。这些变异可能影响蛋白质的活性。最近的研究显示，XRCC1基因多态性与头颈部、肺、食管以及结肠等部位肿瘤的风险相关［2～5］。但XRCC1基因多态性与辐射损伤的关系尚未见报道。我们在控制导致染色体损伤其他危害因素的情况下，探讨XRCC1基因的多态性与辐射损伤易感性的关系，揭示在同样暴露情况下导致损伤程度不同的原因，为寻找筛检电离辐射高危人群的生物学检测指标提供线索和依据，对保护暴露人群的健康具有重要意义。
1 对象与方法
1.1 研究对象
病例组为唐山市从事射线工作且染色体异常的人员（113名）。按性别、年龄（±5岁）、民族、工种配对，选择与病例在同一工作岗位、工龄相近、累积受照剂量相同或相近但无辐射损伤的放射人员为对照（113名）。研究对象共113对，男性93对，女性20对。其中病例组年龄36.50（22～57）岁，工龄10.00（1～35）年；对照组年龄37.00（22～58）岁，工龄10.50（1～36）年。年龄、工龄在两组间的分布差异均无显著性（P>0.05）。病例组累积受照剂量24.75（0.95～84.75）mSv，对照组为24.52（0.59～79.50）mSv，两组差异无显著性（P>0.05）。按照WHO标准（以每天吸烟1支以上，且持续>1年者视为吸烟），病例组中吸烟人数和吸烟率分别为21人和18.58%，而对照组则为26人和23.01%，两组差异无显著性（P>0.05）。病例组中医用X线接触者83例，工业探伤人员18例，其他人员12例。对照组工种与病例组一一匹配。
1.2 问卷调查
采用统一的调查表进行问卷调查，包括基本情况、疾病史、吸烟情况。接触射线种类、累积接触时间、累积受照剂量等资料来自放射人员健康档案。
1.3 主要试剂与仪器
10×PCRmix，限制性内切酶PvuⅡ、RsaⅠ、NciⅠ（MBI公司），引物由Sangon合成；PCRT-1型PCR仪（美国Biometro公司），凝胶成像图像分析仪（美国Uvipro公司），DYC-31A型电泳槽（北京六一仪器厂）。
1.4 染色体分析
采用微量全血培养法。取外周静脉血0.5 ml，加入含20%小牛血清的1640培养基，37 ℃培养54 h，收获前3～4 h加入秋水仙素。常规制片，姬姆萨染色。选择分散良好、形态清晰的中期分裂相200个细胞，油镜下观察染色体畸变情况。染色体畸变类型包括环状染色体、双着丝粒染色体、无着丝粒断片和微小体等。对所观察细胞中期分裂相中出现≥1条染色体异常者均记作1个畸变细胞，计算细胞畸变率。凡出现以下情形之一的即视为染色体异常：环状染色体和双着丝粒染色体≥1%，或无着丝粒断片和微小体≥2%。
1.5 XRCC1基因Arg194Trp、Arg280His和Arg399Gln多态性检测
每一对象取外周静脉血0.5 ml，采用饱和盐析法提取DNA，应用多聚酶链反应-限制性长度多态性分析技术（PCR-RFLP）检测［6，7］。30 μl PCR反应体系中含100 ng模板DNA、上下游引物各0.25 μmol/L、0.2 mmol/L dNTPs（Sangon）、2 mmol/L MgCl2、0.75 U Taq聚合酶，3 μl 10×PCRmix，余下的用去离子水补齐。引物和扩增条件见表1。用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，酶切产物于2%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.6 XRCC1基因型判断
C26304T CT 突变后可被PvuⅡ识别，酶切产物有396和89 bp 2个片段；杂合子产生485、396和89 bp 3个片段，野生型只有485 bp 1个片段。G27466A GA 突变后失去RsaⅠ酶切位点，野生型含酶切产物145和56 bp 2个片段；杂合子产生201、145和56 bp 3个片段，纯合子只有201 bp 1个片段。G28152A野生型等位基因G有2个酶切位点，产生长度为461、278、132 bp的3个片段，GA 突变后失去1个酶切位点，酶切产物为593和278 bp 2个片段；杂合子产生593、461、278和132 bp 4个片段。
1.7 统计分析
应用SAS 6.12统计软件包进行数据分析，非正态分布定量资料选用配对设计的符号等级检验；配对计数资料采用1:1配对χ2检验，计算比值比（OR）及其95%可信区间（CI），表示关联强度。
2 结果
2.1 染色体畸变分布
病例组113人中，无着丝粒断片和微小体≥2%的共21人（18.59%），双着丝粒染色体或环状染色体≥1%的共79人（69.91%），同时出现上述两种情况的有13人（11.50%）。
2.2 XRCC1基因型和等位基因分布频率比较
表2，3，4显示，将病例组与对照组XRCC1基因3个位点进行比较，C26304T位点两组同时携带CT/TT基因型的有23对，病例组携带CT/TT基因型而对照组携带CC基因型的有37对，病例组携带CC基因型而对照组携带CT/TT基因型的有20对，两组同时携带CC基因型的有33对，χ2检验显示两组间分布差异有显著性（P=0.0243），C26304T位点携带CT/TT基因型的射线暴露者发生染色体损伤的风险是携带其他基因型个体的1.85倍（95%CI：1.08～3.16）；G27466A位点和G28152A位点的各基因型在两组间分布差异均无显著性（P>0.05）。
对上述3个位点的等位基因携带率比较显示，26304C等位基因频率病例组（64.16%）低于对照组（77.43%），差异有显著性（P=0.002）；其他两个位点的等位基因频率两组间的分布差异均无显著性（P=0.205，P=0.436）（见表5）。
3 讨论
放射工作人员长期小剂量受到电离辐射照射，可引起细胞遗传学的变化。在事故和一次性大剂量照射情况下，公认为染色体畸变与剂量有相应的关系。但长期接触低剂量射线，染色体损伤程度无明显加重，范雪云等［8］认为可能是小剂量长期照射，机体的损伤与修复基本达到动态平衡，也可能有低剂量辐射诱发的细胞遗传学适应性反应参与。据文献报道，吸烟对射线引起的DNA损伤有协同作用。我们对包括累积受照剂量和吸烟等在内的影响染色体损伤的混杂因素进行了控制，以便探讨XRCC1基因的多态性与辐射损伤易感性的关系。
电离辐射对DNA的损伤主要涉及碱基的损伤和DNA链的断裂［9］。XRCC1是一重要的DNA损伤修复基因，其编码产物作为脚手架蛋白，通过直接与聚合酶β、DNA连接酶Ⅲ和多聚ADP核糖聚合酶［poly（ADP ribose） polymerase，PARP］形成复合物，共同参与因电离辐射和氧化损伤引起的碱基切除修复（BER）和单链断裂修复（SSB）［10］，而且在该过程中可能起重要作用。
电离辐射引起的DNA单、双链断裂既可以产生于自由基对DNA链的直接攻击，也可间接来源于BER通路对不稳定碱基损伤的修复过程。研究显示，XRCC1基因突变细胞系EM9和EM-C11修复电离辐射引起的单、双链DNA断裂的能力均显著降低［11～13］。XRCC1基因突变细胞系存在大量未修复的DNA单链断裂在S期能转化为双链DNA断裂［14］。XRCC1基因突变细胞系（EM-C11）姊妹染色体交换发生率明显升高［15］，验证了大量未修复的DNA单链断裂在S期能转化为双链DNA断裂的假说。
XRCC1 26304位点的CT突变导致其蛋白质中氨基酸Arg194Trp194改变。本研究中XRCC1 26304位点病例组和对照组同时携带CT/TT基因型的有23对，病例组携带CT/TT基因型而对照组携带CC基因型的有37对，病例组携带CC基因型而对照组携带CT/TT基因型的有20对，两组同时携带CC基因型的有33对，χ2检验显示两组间分布差异有显著性（P=0.0243），携带26304CT/TT基因型的射线暴露者发生染色体损伤的风险是携带其他基因型个体的1.85倍（95%CI：1.08～3.16），表明辐射损伤易感性与DNA碱基切除修复基因XRCC1的C26304T单核苷酸多态相关，XRCC1 26304CT/TT基因型可能是辐射致染色体损伤的危险因素。XING等［4］对中国鳞状细胞食管癌患者的研究显示，携带XRCC1 26304TT基因型者发生鳞状细胞食管癌的危险性增加，OR值为2.04（95%CI：1.32～3.14）；宋春英等［16］报道26304位点的CT突变使食管癌风险增高约2倍。但Sturgis等［6］报道XRCC1 26304TT基因型与头颈部肿瘤风险呈负相关。这些结果说明，不同疾病发生的机制不同，与之有关的基因型也不同，同一位点的基因型在不同疾病中所起的作用也不同。G27466A位点和G28152A位点的各基因型在两组间分布差异均无显著性（P>0.05）。
XRCC1基因是第一个分离到的影响细胞对电离辐射敏感性的哺乳动物基因，它广泛参与DNA损伤的修复［17］。XRCC1定位于人类染色体19q13.2～19q13.3，大小为33 kb，包含17个外显子。纯化的XRCC1蛋白由633个氨基酸残基组成。XRCC1 27466位点的GA突变导致其蛋白质中氨基酸Arg280His280改变，28152位点的GA突变导致其蛋白质中氨基酸Arg399Gln399改变。RATNASINGHE等［3］研究显示，携带280His等位基因可能增加患肺癌的危险性，OR值为1.8（95%CI：1.0～3.4）；ABDEL-RAHMAN等［5］对埃及人的研究显示，以399Arg/Arg基因型为参照，具有399Arg/Gln和399Gln/Gln基因型者发生结肠癌的危险性增加，OR值为3.98（95%CI：1.50～10.6）。而本次研究未发现XRCC1 G27466A和G28152A基因多态性与辐射致染色体畸变有关。
目前，XRCC1蛋白功能及XRCC1基因突变如何影响其功能的具体机制尚不完全清楚。本研究显示XRCC1的C26304T位点多态与辐射损伤的发生有关，但是，XRCC1蛋白及其等位基因的功能以及XRCC1基因突变如何影响辐射损伤的发生，还有待进一步研究。
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