1 200 ITU/mg Bti浓悬浮剂的研制

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摘要：通过对苏云金芽孢杆菌以色列亚种Bti L－10菌株进行培养基的改良优化得到一种理化性质好、利于后处理的配方。200 L罐发酵效价达395 itu／μL；通过后处理工艺的优化，得到一种制备1 200 ITU／mg bti浓悬浮剂路线，即发酵液2次离心并高倍浓缩得到菌浆，添加各种助剂经砂磨机研磨，得到Bti浓悬浮剂产品效价达到1 245 ITU／mg。

关键词：苏云金芽孢杆菌以色列亚种；浓悬浮剂；制备工艺

中图分类号：S482．3＋9；TQ453．5 文献标识码： A 文章编号：0439－8114（2011）24－5113-03

Development of 1 200 ITU/mg Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Suspension Concentrate

LIAO Xian－qing，LIU Fang，ZHOU Rong－hua，ZHANG Zun－xia，YANG Zi－wen

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center／ The Branch Center of Biopesticide， Hubei Agricultural Scientific and Technological Innovation Center，Wuhan 430064，China）

Abstract： The culture medium for highly toxic Bacillus thuringiensis subsp. israelensis L-10 strain was obtained by orthogonal tests of nitrogen source. The formula with good physicochemical properties was conducive to the post-treatment. In the pilot fermentation in 200 L fermentors, the potency of the fermentation broth was 395 ITU/μL. After the optimization of post-treatment, the optimal route of 1 200 ITU/mg Bti suspension concentrate was developed. It was prepared by using fermentation broth to the secondary centrifugation and high-powered concentration, then adding additive and grinding with sand mill. Its titer reached 1 245 ITU/mg against mosquito larva.

Key words： Bacillus thuringiensis subsp． israelensis； suspension concentrate； optimal route

蚊类作为主要卫生害虫之一，除叮刺、骚扰人类及动物外，还传播疟疾、丝虫病、乙脑、登革热等多种传染性疾病。防治媒介蚊是控制这类疾病流行的重要措施，而对于尚无有效疫苗的疾病（如登革热）和对治疗药物产生抗药性的疾病（如疟疾），媒介控制在预防其发生和流行方面的重要性就显得更加突出［1］。化学防治在过去几十年的蚊类防治中发挥了较大的作用，但化学杀虫剂的长期大量应用却导致蚊类抗药性产生和环境污染等问题。苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bti）是一种对蚊幼虫有特效作用的病原细菌，Bti在孢子形成时可产生4种主要的伴孢晶体杀虫蛋白毒素――Cyt1A，Cry4A， Cry4B和Cry11A［2］，这些蛋白毒素对蚊有高度的专一性，对包括人类在内的脊椎动物和植物无害，可以完全自然降解，不污染环境，防治对象不易产生抗性，可自身再循环，具有较长的持效期，因此有较广阔的应用和市场前景。

悬浮剂是一种环境友好型的剂型，无粉尘危害，生产安全，以水为分散相，没有由有机溶剂而造成的易燃及药害问题，在水中分散性好，粒径细，可对水喷雾［3］。国外主流Bti产品有Abbott公司开发的200 ITU／mg飘浮剂、1 200 ITU／mg水分散颗粒剂、1 200 ITU／mg悬浮剂等，而我国登记的Bti产品只有传统剂型如200 ITU／μL悬浮剂、1 200 ITU／mg可湿性粉剂，存在运输成本高、有粉尘污染、药效不好等问题，已不能满足需求，迫切需要开发新的剂型。本研究着重于1 200 ITU／mg浓悬浮剂的开发。

1 材料与方法

1．1 材料

Bti L－10菌株由湖北省生物农药工程研究中心工程技术室分离并保存，斜面培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂，液体发酵培养基碳源为玉米淀粉、玉米粉等，氮源为豆粕、花生粕、蛋白胨、鱼粉、大豆蛋白胨、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、酵母抽提物等。供试虫为白纹伊蚊3龄幼虫。

1．2 方法

1．2．1 液体发酵培养基优化 在现有生产配方即对照配方基础上进行改良，固定碳源为玉米淀粉3％，磷酸二氢钾0．1％，硫酸镁0．05％，碳酸钙0．2％，玉米浆 2％，以鱼粉、大豆蛋白胨、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、酵母抽提物等蛋白质含量高、杂质少、溶解性好的氮源取代生产配方中的豆粕、花生粕、棉子饼粉、酵母粉等市售农副产品，各种配方见表1。按各浓度要求配制好，分装于500 mL三角瓶，每瓶装量20 mL，121 ℃灭菌30 min，挑取一环菌苔接种于摇瓶中，置于旋转式摇床振荡培养，温度（30 ±1）℃，转速220 r／min，培养至芽孢和晶体30％分离时下摇床，所得发酵液进行生物测定，重复3次，取其平均值。

1．2．2 200 L发酵罐发酵 按优化筛选的最佳培养基各组分配制好培养基，投料体积120 L，消泡剂0．2％，消前pH 7．5，121 ℃灭菌30 min，待温度降至32 ℃时接入经80 ℃水浴20 min处理的Bti L－10孢子悬浮液，通气量1∶0．6～1．2，培养温度（30±1）℃，罐压0．05 MPa，发酵过程中取样镜检，芽孢和晶体30％分离时结束发酵。

1．2．3 Bti L－10发酵上清液含固量的测定和可溶性增效因子的检定 将200 mL Bti L－10发酵液用台式高速离心机5 000 r／min离心10 min，取80 mL上清液放入不锈钢杯中进行冷冻干燥，得到上清液干燥粉，称重，计算含固量；弃去全部上清液，加入同体积无菌水，将其和发酵液同时进行生物测定，重复3次。

1．2．4 制备路线的选择 试验选用3种制备路线，分别为：

A采取原粉加水的路线。取含量为6 000～7 000 ITU／mg的Bti L－10原粉300 g，加入1 000 mL水，按照文献［4］加入防腐剂、悬浮剂、分散剂，充分混合，调pH至5．0，砂磨机研磨，得到悬浮剂A。

B采取发酵液浓缩的路线。将4 000 mL发酵液用200目分样筛过滤，弃去滤渣，所得滤液调pH至5．0， 台式高速离心机5 000 r／min离心15 min，弃去3 000 mL上清液，得到1 000 mL菌浆，按照文献［4］加入防腐剂、悬浮剂、分散剂，砂磨机研磨，得到悬浮剂B。

C采取发酵液浓缩2次离心的路线。将4 000 mL发酵液用200目分样筛过滤，弃去滤渣，所得滤液调pH至5．0， 台式高速离心机5 000 r／min离心15 min，弃去全部上清液，加水定容至4 000 mL，台式高速离心机5 000 r／min离心15 min，弃去3 000 mL上清液，得到1 000 mL菌浆，按照文献［4］加入防腐剂、悬浮剂、分散剂，砂磨机研磨，得到悬浮剂C。

按照文献［5］进行悬浮率、分散性测定。分别称取100 g 3种悬浮剂，冷冻干燥，得到干燥粉，计算含固量。另将3种悬浮剂分别放置于54 ℃恒温培养箱中进行热贮试验，放置7 d取出进行生物测定和表观性状观察。

1．2．5 生物测定 将A、B、C 3种悬浮剂分别进行生物测定，供试虫为白纹伊蚊3龄幼虫，测定方法参照文献［6］。

2 结果与分析

2．1 液体发酵培养基优化

Bti L－10菌株在不同培养基中摇瓶发酵结果如表2。从表2可以看出，配方1、2、3效果均优于对照配方，并且杂质较少，利于后处理，但配方1原材料价格较高，配方2同步率稍差，扩大时会有影响，考虑到大生产中成本因素，选取配方3作为后续研究的配方。

2．2 200 L发酵罐发酵

发酵周期28 h，发酵24 h时取样镜检，孢囊形成率为98％，菌体大小整齐、两端平直，芽孢端∶晶体端约1∶1。放罐时取样镜检，晶体50％左右脱落，晶体圆形、大、整齐。

2．3 上清液生物测定

上清液含固量为3．2 g／100 mL，发酵液中可溶性增效因子的检定结果见表3。从表3可以看出上清液存在与否对效价没有任何影响，可以认为Bti L－10发酵上清液中没有增效物质，在原药和浓悬剂的制备中可以考虑弃去上清液，减少可溶性杂质，更有利于得到高含量原药；同时在浓悬剂的制备中弃去上清液可以降低由于可溶性残糖等杂质带来的高黏度。

2．4 制备路线对悬浮剂表观和效价的影响

几种制备路线分别得到的悬浮剂的表观性状和效价见表4，效价稳定性情况见表5。因路线A采用原粉加水的工艺，而原粉是由菌浆喷雾干燥得来的，喷雾干燥能耗高、生产成本高、存在粉尘污染等问题，因此采用此工艺很不经济；路线B因上清液里残糖等可溶性杂质含量高达3．2 g／100 mL，带来黏度增加、倾倒困难、防腐难度增加等问题；路线C尽管增加了一次离心操作，但因离心能耗较低，相较于路线A成本大大减少，并且全程没有任何粉尘污染。因此路线C是制备Bti 1 200 ITU／mg浓悬浮剂经济可行的路线，并且热贮稳定性较好，通过添加各种助剂经砂磨机研磨，得到的Bti浓悬浮剂产品效价达到1 245 ITU／mg。

3 讨论

蚊蝇等卫生害虫的防治是一个长期的课题，而生物防治方法具有杀伤力强、不污染环境、不伤害天敌、对人类安全、控制作用比较持久等化学防治无法比拟的优点，因此防治蚊幼虫的药剂Bti有巨大的市场潜力。美国VBC公司Bti 1 200 ITU／mg浓悬浮剂年销量可达1 500 t左右。

诱变育种、原生质体融合育种、分子育种等育种技术的发展与应用，培养基的优化、发酵工艺的优化，使得发酵水平大幅提高；超滤、纳滤、真空薄膜浓缩等技术的发展与应用，带来后处理技术的革新，可更好地解决浓悬浮剂制备过程中的黏度大、含量低等问题，本课题还将继续跟踪深入研究，以期得到更高含量的浓悬浮剂。

参考文献：

［1］ 宋爱军，陈 伟，李京玉．登革热的防控［J］．畜牧与饲料科学，2010，31（11－12）：157．

［2］ 郑大胜，NEIL C，蔡亚君，等．苏云金杆菌以色列亚种杀蚊蛋白Cyt1Aa在离中不粘柄菌中的表达［J］．微生物学报，2007，47（2）：217－220．

［3］ 刘 健，徐 遥，王锁牢，等． 国内外农药剂型的发展及现状简介［J］．新疆农业科学，1998（4）：179－181．

［4］ 廖先清，刘 芳，周荣华，等．17 600 IU／mg苏云金芽孢杆菌浓悬浮剂的研制［J］．湖北农业科学，2010，49（12）：3048－3051．

［5］ 刘步林，郭武棣．农药剂型加工技术［M］．北京：化学工业出版社，2001．

［6］ 陈在佴，吴继星，张志刚．苏云金杆菌99－11菌株培养条件的研究［J］．湖北农业科学，2004（2）：50－52．