微生物检查方法验证及其影响因素分析

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[摘要] 微生物学检查是药品常规安全性检查的重要组成部分。微生物限度检查法方法验证工作十分繁琐，影响因素包括培养基、菌株、试验步骤和供试品的制备方式等。在细菌、真菌及酵母菌计数方法和控制菌检查法的方法验证过程中，分析上述因素对验证结果的影响，提出了供试品的多种有效制备方法，对准确检测出药品中微生物的真实含量具有一定的指导意义和实用价值。

[关键词] 微生物；限度检查法；方法验证；药品质量；供试品；微生物检测

[中图分类号]R927.1 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2008）04（c）-066-03

药品是指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理功能并规定有适应证或者功能主治、用法和用量的物质，包括中药材、中药饮片、中成药、化学原料药及制剂、抗生素、生化药品、放射性药品、血清、疫苗、血液制品和诊断药品等。药品的质量指标包括物理、化学、生物药剂学、安全性、有效性、稳定性和均一性。微生物学检查是药品常规安全性检查的重要部分。药品中污染的微生物通过微生物体及其代谢产物导致机体过敏、感染、中毒等，严重的将危及生命。因为通过不同的给药途径，药品中污染的微生物对机体的影响有着显著的差别，所以药品的临床给药途径是微生物限度检查和方法验证中十分重要的要素。《中国药典》2005年版微生物限度检查法的标准均按给药途径制定，明确规定了药品微生物限度检查方法的验证及检查均按给药途径进行和判定。如外用制剂须检查和验证铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌；口服制剂须检查和验证大肠埃希菌；若制剂含药材原粉和(或) 动物药，还需检查和验证大肠菌群和(或) 沙门菌。通过药品的临床给药途径决定是否需要验证控制菌，需要验证哪种控制菌，以及验证细菌、真菌、酵母菌的检测限度。有了方法验证意味着有证明文件存在，能证明方法准确、灵敏、专属，并能重复地产生可信的结果。

1 微生物检查方法验证的难点问题

多年来人们对药品生产、保存和使用过程中出现的微生物污染问题进行了许多研究和评估。向东[1]研究认为，药品中污染的微生物处于不稳定状态，微生物种类具有不确定性，在药品生产各个环节中，微生物污染存在着不均匀性。因此，为了监控药品的微生物污染，《中国药典》[2]规定对药品进行微生物限度测试，加大控制药品微生物污染的力度。微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法，检查项目包括细菌数、真菌数、酵母菌数及控制菌检查。2005年版《中国药典》于2005年7月1日开始实施。2005年10月11日，国家药典委员会和中国药品生物制品检定所在《关于执行〈中华人民共和国药典〉(2005年版)微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明》(国药典发[2005] 98号，以下简称98号文件)[3]中指出，未经方法学验证的“微生物限度检查”或“无菌检查”结果，决不能给出“符合2005年版《中国药典》的规定”的结论。几乎所有的药品都要在进行安全性检查后方可应用于临床。无论是无抑菌性药物还是抑菌性药物都要进行微生物限度检查，特别是污染于抑菌药物中的微生物在一定条件下是可以稳定存在一段时间的，虽然它们可能受到损伤，但未死亡，在条件改变时，如服用至人体内，当条件适宜时仍可生长繁殖。某些药物在试验条件下呈现抑菌作用并干扰待检菌的检出或计数，但当服用后受到胃液及肠液的稀释，抑菌作用减弱或直接静脉注射入血液，细菌便可复苏并繁殖，对人体造成危害。任何一种抑菌药物均有一定的抑菌范围，即抗菌谱。相当多的抗细菌药物对真菌毫无作用。对所有菌类均敏感的药物几乎是不存在的。细菌对抑菌药物有适应性，耐药性致病菌株在临床上屡见不鲜。所以抑菌药物内是可能存在微生物并可对人体健康造成危害的，因此对抑菌性药物也有必要进行微生物限度检查。但抑菌性药物在检查过程中会有明显的抑菌作用，这在很大程度上影响了微生物的检出。

2 微生物检查方法验证的一般模式及影响因素

2.1 培养基的无菌检查及性能检查

在无菌检查方面，每批培养基全数按使用目的的时间和温度进行预培养，抽取一定数量的培养基进行观察，应无菌生长。使用时应仔细检查每一个碟子，观察其是否有微生物污染，培养基是否干裂或干燥收缩，如有其中任何一项，应丢弃该碟子。

在性能检查方面，经过预培养的培养基按照应测定的微生物，使用标准菌株（5代以内）进行试验。其中控制菌应设定阴性菌对照组，考查专属性。一般还应增加一个在生产环境中发现并且常见的菌株。生产中发现的菌株应检定到种属，并注明来源。

2.2 菌株准备

选择标准菌株，如CMCC(B)、ATCC，但应注意使用的菌株代数不超过5代。

2.3 微生物方法验证的内容

2.3.1细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证内容验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。验证菌株为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、枯草杆菌，菌种要求不得超过5代，菌液制备为10~100 cfu/ml。验证方法分试验组、菌液组、稀释剂对照组、供试品对照组，具体方法如下：

对于试验组，在采用平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1 ml和10~100 cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注低于45℃琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数；在采用薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入10~100 cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。

对于菌液组，需要测定所加的试验菌数。

对于稀释剂对照组，需要考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1毫升供试液含10~100 cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

对于供试品对照组，需要取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

2.3.2 控制菌检查法的验证内容控制菌检查包括大肠菌群、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、铜绿假单胞菌和梭菌检查。试验菌株按规定检查的控制菌选择相应的验证菌株，大肠菌群检查用大肠埃希菌，梭菌检查用生孢梭菌。验证大肠埃希菌、大肠菌群和沙门菌时的阴性对照菌株为金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和梭菌时的阴性对照菌株用大肠埃希菌。菌液制备为10~100 cfu/ml。具体方法如下：

对于试验组，取规定量供试液及10~100 cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

对于阴性菌对照组，设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性，方法同试验组。

2.3.3 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证结果判断指标根据上述试验数据，可以计算供试品组的菌回收率、稀释剂对照组的菌回收率，具体方法为：首先，在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。其次，若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，按此供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。最后，若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。

2.3.4 控制菌方法验证的结果判断按照2005年版《中国药典》的规定，阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。

2.4 特殊供试品的制备

由于有些供试品本身的特性，可能含有抑菌成分，对药品中污染的微生物造成损伤或药品本身色泽会掩盖微生物的肉眼检出，造成假阴性。而这些被微生物污染的药品进入人体后，有些微生物会复苏并繁殖，危及人体健康。在实践中，利用供试品与微生物的差异，来降低或消除供试品对药品中微生物的影响，做到准确检定出药品中微生物的含量，是经常采用的方法。具体包括：

（1）培养基稀释法――计数试验采用此法，1 ml分注入几个平皿（≤10个平皿）降低抑菌浓度或减少供试品的色泽。

（2）薄膜过滤法――利用微孔滤膜阻截细菌，以滤除可溶性成分。

（3）中和法――中和剂应对微生物无毒性，与抑菌性成分结合后的产物对微生物亦应无毒性，或有毒性但不能影响待检菌的检出。如β-内酰胺酶较易破坏青霉素和第一代头孢菌素。

（4）离心沉淀法――悬浮于供试液中的药物颗粒及细菌，由于质量不同可用不同的离心速度分离，一般以短时间低速离心沉淀即可使多数药物颗粒集于管底，难溶性抑菌成分便可借以分离，吸取上层大部分供试液，即可减除其中的抑菌成分。但可能有一些吸附在固体颗粒的微生物随着颗粒被处理掉。细菌细胞个体虽小，但其比重略高于水溶液，可用高速离心将菌细胞收集于管底，弃去上层大部分清液，取管底沉淀液做待检菌检查，可避免抑菌成分对检查的干扰。低速离心一般采用500转/min 离心5 min，收集上清液（菌在上清液中）；高速离心一般采用3 000转/min 离心30 min（或经验证的离心方法回收率达70%以上）弃上清液，等体积重悬沉淀。

（5）沉降法――指抑菌性供试品，当其在水中溶解度较小时，可先按常规方法称量，加规定量的稀释剂制成混悬液，静置数分钟，使难溶于水的抑菌成分自然沉降在容器底部，再吸取上清液检验。

（6）方法综合运用――以泛捷复混悬剂为例，经稀释法中和法薄膜过滤法综合处理供试品后进行需氧菌及控制菌的方法验证，其中青霉素酶单位为每毫升1 000万单位。在需氧菌计数试验组中，其操作步骤为：

① 用0.9%生理盐水把于30~35℃培养18~24 h得到的大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液稀释至每毫升含菌量为10~100个。

② 称取10 g样品至90 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液中，振摇使样品分散，从中吸取10 ml溶液至无菌离心管中，天平平衡，3 000转/min离心20 min，弃上清液约9 ml，离心管中留1 ml，用9 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液重悬沉淀，薄膜过滤，用100 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液（含10 ml青霉素酶）冲洗2次，在第2次冲洗液中加入1 ml的0.9%生理盐水，其中含菌10~100 cfu，过滤，将滤膜贴于含0.15%青霉素酶的TSA平皿上，于30~35℃恒温培养箱中培养2 d。

在控制菌试验组中，其操作步骤为：

① 用0.9%生理盐水把于30~35℃培养18~24 h得到的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌悬液（作为阴性对照）稀释至每毫升含菌量为10~100个。

② 称取10 g样品至90 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液中，振摇使样品分散，从中吸取10 ml溶液至无菌离心管中，天平平衡，3 000转/min离心20 min，弃上清液约9 ml，离心管中留1 ml，用9 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液重悬沉淀，薄膜过滤，用100 ml的pH7.2磷酸盐缓冲液（含10 ml青霉素酶）冲洗2次，将滤膜放置于90 ml乳糖肉汤中，加入1 ml的0.9%生理盐水，其中含菌10~100 cfu，振摇混匀，于30~35℃恒温培养箱中培养24~48 h，用接种环从增殖肉汤中挑取部分样品至麦康凯琼脂培养基上，涂开，将其置于30~35℃恒温培养箱中培养36~48 h。

按照上述方法样品制备后，对需氧菌、控制菌进行3次独立的微生物检测方法验证。需氧菌检测方法验证结果如表1所示。而控制菌检测方法验证结果为：试验组检出试验菌，阴性菌对照组未检出阴性对照菌。

由此可见，综合运用稀释法沉降法中和法薄膜过滤法比单独用某种方法效果好，可以有效地消除抑菌性药物中的抑菌成分的干扰，药品中的菌易被检出，从而可以对抑菌性药物进行微生物限度检查。

3 讨论

微生物方法验证通过后，应严格按验证确立的方法进行供试品的微生物检查。药品微生物限度检查方法验证工作是一个极繁琐、复杂、耗时耗材的操作过程，周期长，干扰因素多,控制不当很难达到验证要求和效果。这就要求验证单位必须具有良好的实验环境、实验设施和工作条件，要求实验工作者具有一定的理论基础和工作经验，严格按操作规范进行操作，减少和避免方法验证结果的误差。应使微生物方法验证资料资源共享，促进我国药品微生物限度检查工作的快速发展。

[参考文献]

[1]向东.影响微生物限度检查及方法验证的因素分析[J].现代医药卫生，2007，23(15): 2329-2330.

[2]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京：化学工业出版社, 2005.1.

[3]关于执行《中华人民共和国药典》（2005年版）微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明[S]. 国药典发[2005]98号.

（收稿日期：2008-03-04）

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