miR-200c对TGF-β1刺激后人瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的影响

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[摘要]目的：观察转染mir-200c mimics 对人瘢痕疙瘩成纤维细胞（HKFs）胶原蛋白分泌的影响。方法：将miR-200c mimics用oligofectami脂质体转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞后，3H-脯氨酸掺入法测加入 50μg／L剂量的转化生长因子(tgf-β1) 刺激前后胶原蛋白水平的变化。结果：转染miR-200c mimics后，胶原蛋白分泌水平降为正常皮肤成纤维细胞表达水平；经TGF-β1刺激后，其蛋白水平仍无明显变化。结论：miR-200c可明显抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原蛋白分泌，推测其机制是通过抑制TGF-β1生物学作用。

[关键词]miR-200c；人瘢痕疙瘩成纤维细胞；胶原蛋白；转化生长因子-β1

[中图分类号]R619+.6 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）02-0242-03

Effect of miR-200c on collagen secretion in TGF-β1-stimulated human keloid fibroblasts

MENG Xi-yong

(Department of Plastic Surgery,No.421 Hospital of Chinese PLA, Guangzhou 510318,Guangdong,China)

Abstract: Objective To investigate the effect of miR-200c mimics on collagen secretion in human keloid fibroblasts(HKFs). Methods miR-200c mimics were transfected by oligofectami package. The collagen level was measured by 3H-proline incorporation method before and after HKFs were stimulated by transforming growth factor betal (TGF-β1) of the dosage of 50μg/L. Results The collagen level was decreased to the normal skin fibroblasts level and had no obvious change even after stimulated by TGF-β1. Conclusion miR-200c can inhibit the expression of collagen in HKFs.The mechanisms may be inhibit the biological effects of TGF-β1.

Key words:miR-200c;human keloid fibroblasts;collagen;TGF-β1

瘢痕疙瘩是皮肤损伤如创伤、烧伤或手术后引发的以胶原过度沉积于真皮和皮下组织为特征的过度瘢痕化，其发病机制目前仍不明确，但公认为其是多种因素共同作用的结果。转化生长因子β1(transforming growth factor betal，TGF-β1)是已知的与瘢痕疙瘩形成关系最为密切、最具代表性的细胞因子，它的异常表达会促进病理性瘢痕的形成[1]。MicroRNA(miRNA)是一种小非编码RNA，通过调节基因表达影响多种生物学行为，包括细胞增殖、凋亡和分化[2-3]。miRNAs与瘢痕的研究报道较少，但已有大量报道表明miRNAs与多种皮肤病有密切关系[4]。例如miR-200家族在皮肤黑素瘤细胞的侵袭模式和形态差别均起不同的调节作用[5]。已证实miR-200c能够对抗并逆转TGF-β1诱导出现的上皮-间质转化[6],并且miR-200c在瘢痕疙瘩组织中表达比正常组织的低6.92倍[7]，基于此，本研究旨在探讨在人瘢痕疙瘩成纤维细胞（HKFs）中过表达miR-200c能否对抗TGF-β1诱导胶原蛋白分泌的作用，为瘢痕疙瘩的基因治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料：TaKaRa总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；荧光标记FAM-miR-200c mimics及其nagetive control、miR-200c特异性 qRT-PCR检测试剂盒（SYBR Green法，含人miR-200c特异性引物和U6内参）购自上海吉玛公司，TGF-β1购自美国Santa Cruz公司；胎牛血清、RPMI1640培养基及oligofectami脂质体购自Invitrogen公司；胰酶购自南京凯基公司。

1.2 实验方法：人瘢痕疙瘩成纤维细胞的培养：取整形手术中切下的瘢痕疙瘩组织及正常皮肤组织在无菌条件下经漂洗，消毒，剪碎成0.5cm×0.5cm大小的组织块，接种于培养瓶内，置37℃，50ml/L CO2中培养箱中培养4h，再加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中继续培养。每周换液2次，待原代培养细胞近融合时经胰酶消化传代。所用细胞为第3～5代。实验分6组：①正常皮肤成纤维细胞组，简称正常组；②HKFs不加任何处理因素，简称空白组；③HKFs转染negative control，简称nc组；④HKFs转染 FAM-miR-200c mimics，简称mimics组；⑤HKFs+50μg/L TGF-β1，简称TGF-β1组；⑥HKFs+50μg/L TGF-β1+FAM-miR-200c mimics（简称混合组）：作用24h后将FAM-miR-200c转染至HKFs。细胞转染方法按照说明书进行，negative control及mimics用量为说明书推荐的中间用量。

1.3 miR-200c转染效率检测：转染后每隔12h于荧光显微镜下观察细胞荧光强度和密度，在荧光强度和密度最强时提取nc组和mimics组细胞总RNA，经逆转录后荧光定量PCR检测miR-200c的表达效率，操作按说明书进行，每组重复3次实验。

1.4 3H-脯氨酸掺入法测成纤维细胞胶原蛋白合成：细胞l×104/孔分别种于24孔培养板上，处理36h后吸弃上清液，加入3H-脯氨酸继续培养10h，多孔收集器收集细胞于玻璃纤维纸上，液闪测定仪闪烁记数测定3H-脯氨酸掺入量。每组设3个复孔。

1.5 统计学分析：采用SPSS13.0软件，miR-200c转染效率数据用两独立样本t检验，各组胶原蛋白数据比较用单因素方差分析，P

2 实验结果

2.1 miR-200c转染效率检测结果：转染36h荧光密度和强度最大（图1），荧光定量PCR检测显示转染36h，mimics组的miR-200c表达量是nc组的15.48倍（图2），证明在HKFs中过表达miR-200c成功。

2.2 miR-200c对HKFs胶原合成的作用：正常组、空白组、nc组、mimics组、TGF-β1组及混合组的3H-脯氨酸掺入率分别如表1所示，HKFs的胶原合成明显比正常皮肤成纤维细胞强（t=-13.963,P=0.000）；miR-200c作用HKFs后，胶原合成与正常皮肤成纤维细胞无明显差异（t=1.426,P=0.227），TGF-β1可以明显增加成纤维细胞胶原的合成(t=-10.875,P=0.000)；而miR-200c对TGF-β1刺激后的HKFs胶原合成有明显抑制作用(t=20.326,P=0.000)，胶原合成降为正常皮肤成纤维细胞表达水平。

3 讨论

3.1 瘢痕疙瘩又称蟹足肿，是一种生长较为活跃，极少进入成熟期的瘢痕组织，表现为皮肤在创伤后成纤维细胞活性的异常增高，大量结缔组织沉积而导致瘢痕过度增生，超出原有损害范围，常严重损害患者容貌外观，并伴有痒痛，影响生活质量。瘢痕疙瘩在临床常见且治疗颇为棘手，迄今为止尚无有效的方法。目前研究提示瘢痕的形成与成纤维细胞对TGF-β1的敏感性增加密切相关，抑制TGF-β1的生物学作用可降低成纤维细胞增殖，有助于改善瘢痕的形成，对瘢痕的治疗有一定的指导作用[8]。

3.2 miRNAs是一类长度大约22个核苷酸（nt）的链非编码RNA大家族，它由DNA转录产生，但并不翻译蛋白质，而是在蛋白质合成中起调节其他基因的功能，是调控其他蛋白质编码基因的基因。随着miRNAs在不同生物中的大量发现，对miRNAs功能的研究越来越引起人们的重视，已经成为近年来的研究热点。已有大量报道表明miRNAs与多种皮肤病有密切关系[4]，但miRNA s在瘢痕疙瘩病理形成中的机制目前仍然缺少报道。miR-200c属于miRNA-200家族一员（miRNA-200家族包括miR-141,miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-429），miRNA-200家族与肿瘤的侵袭、转移甚至肿瘤干细胞均有密切关系。研究表明miR-200c在瘢痕疙瘩组织中的表达比正常组织明显降低，它的表达失调可能与瘢痕疙瘩的形成有密切关系[7]。而在系膜细胞中上调miR-200c可以影响诱导TGF-β1[9],且已证实miR-200c能够对抗并逆转TGF-β1诱导出现的上皮-间质转化[6]，说明miR-200c能影响TGF-β信号通路进而触发一系列生物学改变。

3.3 本实验在HKFs转染miR-200c的mimics从而使HKFs恢复miR-200c的表达，通过荧光定量PCR检测显示转染成功。通过3H-脯氨酸掺入法测各组成纤维细胞胶原蛋白合成变化，发现miR-200c能显著抑制HKFs胶原合成，经统计与正常皮肤成纤维细胞胶原合成无差异，且在TGF-β1刺激下胶原水平仍无明显变化，提示miR-200c可以明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的胶原合成，根据已有研究及结合本实验结果推测其机制至少是miR-200c通过抑制TGF-β1的生物学作用而实现，但由于一个miRNAs可以调控数十乃至上千个基因，故其中牵涉到的分子生物学机制尚待进一步研究。

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[4]Gu W,An J,Ye P,et al. Prediction of conserved microRNAs from skin and mucosal human papillomaviruses[J]. Arch Virol,2011,156(7):1161-1171.

[5]Elson-Schwab I, Lorentzen A, Marshall CJ. MicroRNA-200 family members differentially regulate morphological plasticity and mode of melanoma cell invasion[J]. PLoS One,2010 ,5(10): e13176.

[6]Korpal M,Lee ES,Hu G,et al.The miR-200 family inhibits epithelial-mesenchymal transition and cancer cell migration by direct targeting of E-cadherin transcriptional repressors ZEB1 and ZEB2[J].J Biol Chem,2008,283(22):14910-14914.

[7]Liu Y,Yang D,Xiao Z,et al.miRNA Expression Profiles in Keloid Tissue and Corresponding Normal Skin Tissue[J]. Aesthetic Plast Surg,2011,DOI: 10.1007/s00266-011-9773-1.

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[收稿日期]2011-09-13 [修回日期]2011-11-19