蟾毒灵体内外抗肿瘤作用及制剂研究进展
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[摘要] 蟾毒灵是中药蟾酥中的一种活性单体，能抑制多种实体瘤及白血病肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，逆转肿瘤细胞耐药，抑制肿瘤细胞迁移和浸润。该文就蟾毒灵对肝癌、肺癌、肠癌、胃癌、膀胱癌等多种肿瘤的体内外抑制作用及机制的最新研究成果进行了详尽综述，并综括了其新型制剂的研究进展，以期为其更深入的研究和应用提供参考。
[关键词] 蟾毒灵；抗肿瘤；体外；体内；制剂
[收稿日期] 2014-02-12
[基金项目] 国家自然科学基金项目（81202930）；江苏省高校自然科学研究面上项目（12KJB350002）；江苏大学高级人才科研启动基金（11JDG122）
[通信作者] 许颖，讲师，博士，Tel：（0511）85038451，E-mail：
蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍B. melanostictus Schneider的耳后腺或皮肤腺分泌的白色浆液经加工干燥而成的固体物[1]，具有解毒、止痛、开窍醒神之功能[2]，用于痈疽疔疮、咽喉肿痛、中暑神昏、腹痛吐泻等，临床使用历史悠久[3]。蟾酥中化学成分复杂，蟾毒灵（bufalin）是蟾酥中抗肿瘤作用最强的蟾酥二烯酸内酯之一，较蟾蜍毒素中其他单体而言，蟾毒灵的抗肿瘤作用更强而副作用却相对较低[4]。蟾毒灵分子式C24H34O4，相对分子质量386. 5，熔点238～244 ℃，难溶于水。蟾毒灵具有抗肿瘤、强心、升压、兴奋呼吸、抗炎、增强免疫力及局麻等生理活性。但由于其与蟾蜍二烯羟酸内酯及地高辛具有相似的结构，导致其高剂量时会产生心律失常、呼吸困难、昏迷等毒性[5]。
蟾毒灵对多种实体瘤及白血病肿瘤细胞表现出强烈的抑制作用，具有不容忽视的诱导肿瘤分化和凋亡作用。目前临床应用的蟾酥类抗肿瘤产品有蟾酥注射液、华蟾素注射液等，但尚未有蟾毒灵单体制剂。由于其卓越的抗癌效果，蟾毒灵得到了越来越多的关注，其制剂研究，特别是新型纳米给药系统报道日渐增多。本文对近几年来蟾毒灵对肝癌、前列腺癌、肺癌等各种实体瘤及白血病肿瘤的体外抗癌作用、荷瘤动物体内抗肿瘤效果及其新型制剂的最新研究进展进行了详尽的综述，以期能为其更深入的研究和应用提供参考。
1 蟾毒灵体外抗肿瘤作用
1.1 肝肿瘤 蟾毒灵在抑制肝癌细胞增殖方面取得了令人瞩目的效果。蟾毒灵显示出比多激酶靶向抑制剂索拉菲尼更强的肝肿瘤细胞抑制效果，Cao等[6]考察了蟾毒灵及索拉菲尼对人肝癌PLC/PRF/5及HepG2细胞的抑制作用，结果表明蟾毒灵对肝癌细胞的抑制作用大大超过了索拉菲尼。索拉菲尼对PLC/PRF/5及HepG2细胞增殖抑制的IC50分别为3 565.7，5 719.21 nmol・L-1；而蟾毒灵对PLC/PRF/5及HepG2细胞增殖抑制的IC50仅为157.87，33.65 nmol・L-1，蟾毒灵与索拉菲尼联合使用，还可以通过下调ERK增强索拉菲尼的对肝肿瘤细胞的抑制效果。研究表明[7]，蟾毒灵能够下调肝肿瘤细胞HepG2细胞周期相关蛋白的表达，诱导HepG2细胞阻滞于G2/M期，抑制HepG2细胞的生长。蟾毒灵与华蟾素注射液中另外2个主要成分华蟾酥毒基、酯蟾毒配基相比，对肝肿瘤细胞SMMC-7721，BEL7402有更强的抑制作用，达到相同生长抑制效果所需浓度低于丝裂霉素[8]。Qi F等[9]研究表明蟾毒灵与华蟾酥毒基能通过Fas-及线粒体介导的途径诱导HepG2细胞凋亡，特别是Fas-介导的Caspase-10途径。最新研究表明，蟾毒灵可触发HepG2细胞自我吞噬机制，增强Beclin-1的表达及LC3-I向LC3-II转化，降低p62的表达以及mTOR信号的活化。蟾毒灵能够诱导HepG2细胞发生程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD），尤其是自我吞噬，其发生的机制可能是AMPK-mTOR依赖性的[10]。Hsu等[11]考察了蟾毒灵对3种人肝癌细胞Huh7，Hep3B及HA22T的作用效果及机制，结果表明，蟾毒灵能通过增强JNK激酶通路诱导肝癌细胞自我吞噬，诱导THF，BECN-1，MAPK及ATG8上调，以及Bcl-2和Bid下调。
蟾毒灵在逆转肝癌细胞多药耐药方面也显示出卓越的效果。孟晓燕等[12]研究了蟾毒灵对人肝癌多药耐药BEL7402/5-FU细胞增殖的影响，采用流式细胞术检测1.00，0.10，0.01 μmol・L-1蟾毒灵作用24 h对细胞凋亡率及细胞周期的影响。BEL7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿霉素、长春新碱几种化疗药物均表现出不同程度的耐药性，而蟾毒灵对BEL7402亲本及耐药细胞24，48 h的半数抑制浓度无统计学差异，可明显抑制BEL7402/5-FU细胞生长，表明蟾毒灵对BEL-7402/5-FU细胞无交叉耐药性，其增殖抑制作用呈现时间、浓度依赖性。
1.2 肺癌 Jiang等[13]发现蟾毒灵能够抑制人非小细胞肺癌细胞株A549增殖，呈时间及浓度依赖性。有研究表明[14]，蟾毒灵能通过抑制PI3K/Akt通路诱导肺癌细胞凋亡，包括协同Akt抑制因子诱导A549肺癌细胞株凋亡，同时上调Bax表达，下调Bcl-2及livin基因表达，活化 Caspase-3。蟾毒灵在体外细胞实验及体内动物实验中对耐药肺癌细胞株都表现出逆转效果。细胞实验表明[15]，蟾毒灵能够逆转HGF-诱导的可逆及不可逆性EFGR-TKIs耐药肺癌细胞PC-9，HCC827及 H1975，其机制主要是通过抑制Met/PI3K/Akt通路。荷瘤动物体内实验研究表明，蟾毒灵能逆转肺腺癌NCI-H1975 细胞对吉非替尼耐药，其作用机制可能与阻断EGFR-PI3K/Akt 信号通路有关[16]。
1.3 肠癌 蟾毒灵对大肠癌细胞HCT116细胞株生长抑制具有浓度-时间依赖性，可将细胞周期阻滞于S期[17]。蟾毒灵不仅可以抑制结肠癌细胞SW620细胞株的生长，还可诱导其凋亡，其机制可能是通过活化Caspase-3，上调Bax，下调livin基因及Bcl-2，抑制Jak-stat3信号通路[18]。Xie等[19]考察了蟾毒灵对人结肠癌细胞HT-29及Caco-2细胞的作用效果，研究认为与其他肿瘤细胞常见的促凋亡机制不同，蟾毒灵不会引起结肠癌细胞Caspase依赖性的细胞死亡，没有出现多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及Caspase-3裂解等明显的早期凋亡现象，而是激发了自吞噬途径，明显的特征是LC3-II积累及autophagic flux的刺激。蟾毒灵引起的自吞噬与活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生有关，ROS通过JNK[c-Jun NH（2）-terminal kinase]途径激活自吞噬。
1.4 胃癌 蟾毒灵可抑制胃癌MGC803细胞增殖，蟾蜍灵浓度为0.01～0.1 μmol・L-1时可明显诱导肿瘤细胞在G2/M期阻滞，p16，p21，pRb蛋白表达明显上调[20]。研究中发现，PI3K/Akt通路在蟾毒灵诱导胃癌细胞MGC803凋亡过程中可能发挥了重要作用，蟾毒灵作用于MGC803细胞后，PI3K/Akt通路发生了瞬时活化，随后被完全抑制，PI3K上游调节器CbI上调[21]。蟾毒灵联合奥沙利铂可协同诱导胃癌MGC803细胞凋亡，联合用药组的细胞增殖抑制率高于单药组，其机制可能与下调Bcl-2、上调Bax蛋白有关[22]。张晔等[23]发现蟾毒灵对顺铂耐药胃癌细胞（SGC7901/CDDP）的抑制作用具有时间和剂量依赖性，SGC7901/CDDP细胞经10，50，100 nmol・L-1的蟾毒灵处理后，促凋亡基因Bax表达逐渐上调，抗凋亡基因Bcl-2表达逐渐减弱。
1.5 白血病 有大量研究表明，蟾毒灵对人白血病细胞U937，HL-60增殖具有抑制作用，其机制可能是通过影响Bcl-2蛋白表达， 及调节转录因子NF-κB及AP-1的活化等[24-26]。Zhu等[27]研究发现蟾毒灵能够抑制人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞的增殖，并诱导NB4细胞凋亡，具有浓度和时间依赖性，其机制可能是通过下调survivin表达及上调Caspase-3活化。蟾毒灵对人白血病多药耐药细胞也显示出不俗的抑制效果。方凡夫等[28]考察了蟾毒灵对人白血病多药耐药K562/VCR细胞株增殖的抑制作用，发现人白血病多药耐药K562/VCR细胞株对蟾毒灵无交叉耐药性，蟾毒灵可诱导耐药细胞周期阻滞和细胞凋亡。0.01 μmol・L-1的蟾毒灵即可诱导耐药细胞出现典型的细胞凋亡形态学特征，0.001 μmol・L-1的蟾毒灵可显著下调K562/VCR多药耐药细胞中TS蛋白的表达。
1.6 膀胱癌 蟾毒灵能够通过活化内在的及外源途径诱导人膀胱癌细胞凋亡。Hong等[29]研究表明，蟾毒灵抑制膀胱癌T24细胞增殖具有浓度依赖性，诱导细胞在G2/M期阻滞，发生凋亡，其机制与Caspase-3，-8，-9 蛋白水解活化（proteolytic activation）及多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶降解有关，还会导致Bax/Bcl-2（或Bcl-xL）比值增加，IAP蛋白抑制下调。也有研究显示[30]，蟾毒灵能诱导细胞在GO/G1期阻滞，发生凋亡，cyclin D，CDK4，cyclin E，CDK2，phospho-Rb，phospho-AKT 及 Bcl-2下调，同时cytochrome c，Apaf-1，AIF，Caspase-3，-7，-9，Bax蛋白表达上调及Caspase活化。
最新研究表明[31]，蟾毒灵具有抗肿瘤迁移的活性，Hong等发现蟾毒灵能明显抑制膀胱癌T24细胞迁移及浸润，其机制主要是通过收紧紧密连接（TJS）及抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）MMP-2，MMP-9，这一过程很可能与活化ERK通路相关。
1.7 骨肉瘤 蟾毒灵能抑制人骨肉瘤细胞生长，且其抗肿瘤作用不受甲氨蝶呤化疗药物耐药的影响。王晋等[32]发现蟾毒灵能明显抑制骨肉瘤细胞U-2OS和甲氨蝶呤（MTX）耐药骨肉瘤细胞U-2OS/MTX300细胞的增殖，其IC50分别为（8.49±2.1），（10.19±1.7） μg・L-1 。将蟾毒灵作用于2种细胞48 h后，细胞均出现明显的染色质凝集，有典型的凋亡小体产生，其作用具有浓度依赖性。蟾毒灵诱导骨肉瘤细胞凋亡，其作用机制是通过阻滞细胞周期于G2/M期、上调p53，Bax表达和下调Bcl-2的表达实现。蛋白质组学研究表明，热休克蛋白（heat shock protein 27，Hsp27）的显著下降，在蟾毒灵诱导骨肉瘤细胞凋亡过程中发挥了重要作用[33]。蟾毒灵作用于骨肉瘤U-2OS细胞后，也表现出抗肿瘤迁移和浸润的活性，研究表明蟾毒灵能够通过抑制MMP-2，及阻塞MAPKs信号，如JNK1/2，ERK1/2信号，有效抑制U-2OS细胞的转移[34]。
1.8 胰腺癌 体外细胞学实验表明[35]，蟾毒灵能抑制人胰腺癌BxPC-3细胞的增殖，作用效果呈现时间及浓度依赖性，其作用机制可能是通过激活JNK信号通路，下调BxPC-3细胞Survivin mRNA的表达。Chen等[36]考察了蟾毒灵与吉西他滨联合给药对3种胰腺癌细胞株（Bxpc-3，Mia PaCa-2及Panc-1）的作用效果，研究发现，联合给药组能够上调（ASK1）/JNK，比单药组显示出更强的肿瘤细胞抑制及促凋亡效果。
1.9 前列腺癌 Yeh等[37]发现前列腺癌细胞株DUl45，LNCaP和PC3经蟾毒灵作用后，细胞内的钙离子浓度均有所增加，DUl45和PC3细胞内Caspase-3活性，及LNCaP细胞内Caspase-9活性增强，前列腺癌细胞发生凋亡。Yu等[38]研究表明，蟾毒灵和华蟾酥毒基能够通过一系列的凋亡调节机制，包括Bax、细胞色素C及Caspase，抑制前列腺癌细胞LNCaP，DUl45和PC3的增殖，作用于激素依赖型细胞LNCaP的是上游调节器P53， 而作用于非激素依赖型细胞DU145和PC3是上游调节器Fas。
1.10 妇科肿瘤 蟾毒灵对子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌等几种恶性妇科肿瘤细胞都表现出明显的抑制效果。Nasu等研究表明，蟾毒灵能诱导子宫内膜癌ECSC细胞在GO/G1期阻滞，发生凋亡，经蟾毒灵作用后，ECSC细胞中cyclin A，Bcl-2及Bcl-X（L）表达下调，p21及Bax表达上调，Caspase-9活化[39]。Takai等[40]考察了蟾毒灵对3种人子宫内膜癌细胞株（Ishikawa，HHUA，HEC-1B）、2种卵巢癌细胞株（SK-OV-3，OMC-3）及正常的人子宫内膜上皮细胞的作用效果，发现蟾毒灵对几种妇科恶性肿瘤细胞都显示出很强的抑制作用，当蟾毒灵为1 μg・L-1时，几种肿瘤细胞的抑制率都超过50%，并多被阻滞在GO /G1周期，而正常人子宫内膜上皮细胞生长几乎不受影响。对TRAIL耐药的乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231细胞株，在蟾毒灵的作用下可被TRAIL诱导凋亡，实验表明，蟾毒灵能够上调DR4和DR5，活化ERK，JNK及p38 MAPK，同时下调CbI-b，逆转TRAIL耐药[41]。
2 蟾毒灵体内抗肿瘤作用
蟾毒灵不但在体外细胞学实验中显出优异的抗肿瘤作用，在一些肿瘤动物模型中也表现出明显的抑瘤效果。顾伟等[42]建立了裸鼠人肝癌原位移植模型，考察蟾毒灵对肝肿瘤的抑制效果及对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。研究发现，蟾毒灵高、中、低3个剂量组（5，1，0.5 mg・kg-1）肿瘤体积均较模型组（不进行药物干预）明显缩小（P
康小红等[16]建立了EGFR-TKIs 耐药的肺腺癌NCI-H1975 细胞裸鼠皮下移植瘤模型，将荷瘤动物随机分为模型组（不进行药物干预）、吉非替尼组、蟾毒灵组及吉非替尼和蟾毒灵联合用药组（每组10 只）。分别用相应药物干预3周后，模型组、吉非替尼组、蟾毒灵组和联合用药组的抑瘤率分别为0%，16.14%，33.48%，60.39%。模型组、吉非替尼组、蟾毒灵组和联合用药组的移植瘤组织中肿瘤细胞凋亡率分别为（13.11±1.60）%，（15.48±0.43）%，（45.09±3.81）%，（75.8±3.16）%，联合用药组移植瘤组织中p-EGFR，p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平显著下调（P
王杰等[43]考察了蟾毒灵对人结肠癌细胞株HCT-116 建立的裸鼠原位移植瘤模型的治疗效果，结果显示各剂量组裸鼠的生存时间与阴性对照组相比明显延长；蟾毒灵1.0，1.5 mg・kg-1剂量组和5-FU 组与阴性对照组相比，移植瘤的坏死程度显著增加（P
为了探讨蟾毒灵诱导人胰腺癌细胞凋亡的情况，胡强[44]等建立了胰腺SW 1900细胞株裸鼠移植瘤模型，随机分为4组，分别腹腔给予生理盐水（NS 20 mL・kg-1）、5-氟尿嘧啶（5-Fu，24 mg・kg-1）、蟾毒灵（BU 1 mg・kg-1）、蟾毒灵加5-氟尿嘧啶（BU 1 mg・kg-1+5-FU 24 mg・kg-1），研究发现，与NS组相比，各治疗组均显著诱导了胰腺癌细胞的凋亡（P
3 蟾毒灵制剂研究
蟾毒灵虽然对肿瘤细胞具有显著的抑制和杀伤效果，但由于其具有较强的心脏毒性，体内半衰期短，治疗窗狭窄，临床应用受到了限制，尚未有蟾毒灵单体制剂应用于临床。近年来，蟾毒灵的抗肿瘤作用日益得到人们的重视，相关的制剂开发研究，特别是新型纳米制剂的研究报道不断涌现。
3.1 口服制剂 蟾毒灵水溶性差，口服不易吸收。Liu等制备了麦胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）修饰的PVA脂质纳米粒，纳米粒平均粒径为164 nm，zeta电位为-10.6 mV，包封率为68.2%，WGA的连接率约为28.9%。通过载入香豆素-6，采用激光共聚焦显微镜可观察到WGA修饰后的纳米载体可增强纳米粒在Caco-2细胞中的摄取。黏附性实验显示，经WGA修饰的纳米粒与未经修饰的普通纳米粒相比，可显著增强在小肠黏膜的黏附（P
3.2 非胃肠道给药系统 苏永华等采用去溶剂化及物理包覆吸附法制备了蟾毒灵白蛋白纳米粒，平均粒径为100 nm，体外释放实验显示出明显的缓释特性。大鼠体内药动学实验显示，蟾毒灵纳米粒组的AUC，MRT及t1/2分别是蟾毒灵组的1.19～1.81，2.13～3.61，2.17～2.94倍[47]。
为了降低蟾毒灵的毒副作用，增强靶向性，Yin等[48]制备了载蟾毒灵mPEG-PLGA-PLL-cRGD 纳米粒（BNPs），平均粒径为（164±84） nm，Zeta电位为2.77 mV，包封率为（81.7±0.89）%，载药量为（3.92±0.16）%。体外释放实验24 h后，仅有50%的药物从纳米粒中释放，纳米粒释放90%的时间可达192 h，具有明显的缓释效果。大鼠体内药动学实验表明，给药24 h后，BNPs给药组仍可检测到药物，MRT及t1/2约为溶液组的1.77，2.14倍。体外细胞实验显示，给药浓度≥4 nmol・L-1时，BNPs对肿瘤细胞SW620的抑制效果显著高于溶液组（P
3.3 其他 陈黄琴等[49]制备了复合蟾毒灵的壳聚糖/纳米羟基磷灰石人工骨用于骨肉瘤的化疗及修复重建，体外模拟液浸泡实验表明制剂能在体外缓慢释放达16 d，作用于骨肉瘤细胞U-2OS后，能长期有效抑制骨肉瘤细胞的增殖，并具有浓度依赖性，从培养的第4天开始蟾毒灵组细胞抑制率100 mg・L-1>50 mg・L-1>25 mg・L-1。
4 结语
蟾毒灵是一种非常有潜力的多靶点抗肿瘤中药活性成分，几乎对各种实体瘤及白血病肿瘤都显示出诱导肿瘤细胞凋亡的效果。除诱导肿瘤细胞凋亡外，在对肝癌、肺癌、胃癌等多种实体瘤及白血病肿瘤细胞作用中都表现出逆转肿瘤细胞耐药的效果，在对膀胱癌和骨肉瘤的细胞实验中还显示出抗肿瘤细胞迁移和浸润的效果。除体外细胞实验外，蟾毒灵在体内荷瘤动物模型中，对肝癌、肺癌、肠癌、胰腺癌都显示出明显的抑瘤效果。蟾毒灵具有显著的抗癌效果及广阔的发展前景，在未来的研究中，先进的研究手段及新型制剂技术的应用将会使蟾毒灵发挥出巨大的临床应用价值。
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Research progress of in vitro and in vivo anti-tumor
effects and formulation of bufalin
XU Ying， CHEN Mei， JIN Xue-feng， QIAN Chen， XU Xi-ming， ZHANG Xuan
（1.School of Pharmacy， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China；
2.Jiangsu Aosaikang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Nanjing 211100， China）
[Abstract] Bufalin is an active compound of the traditional Chinese medicine Chansu， which exhibits significant anti-tumor activities in many solid tumors and leukemia cell lines. Bufalin could introduce apoptosis， reverse drug-resistance， and prevent migration and invasion of tumor cells. This paper reviewed the latest research progress of the in vitro and in vivo anti-tumor effect and mechanism of bufalin on a series of cancers， such as hepatocellular carcinoma， lung cancer， colon cancer， gastric cancer， leukemia， bladder cancer， and its formulation study is also summarized for the reference of its further study and application.
[Key words] bufalin； anti-tumor； in vitro； in vivo； formulation
doi：10.4268/cjcmm20141508