鸭黄病毒荧光定量PCR检测方法的建立

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摘要：根据鸭黄病毒HBJL株NS5基因序列设计合成了引物和探针，通过对荧光定量pcr反应条件的优化，建立了TaqMan荧光定量PCR检测鸭黄病毒的方法。结果表明，该方法具有很好的特异性和重复性，荧光定量PCR敏感性是常规PCR的100倍左右。同时对30枚人工接种的鸭胚进行检测并与常规PCR方法进行比较，检测结果也表明荧光定量PCR法比常规PCR的敏感性高。

关键词：鸭黄病毒；TaqMan探针；荧光定量PCR

中图分类号：S852.65+9.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5811-03

2010年以来，中国上海、浙江、江苏等地出现了蛋鸭产蛋量严重下降及蛋鸭死亡现象。同年在湖北省一些养鸭场也出现不明原因引起的产蛋量下降现象，临床表现为产蛋量严重下降甚至停止，且蛋鸭有一定的死亡率，剖检病死鸭脾脏呈现明显肿大，卵巢肉变，卵泡严重充血，出血[1]。

临床诊断为鸭黄病毒感染引起的病毒病感染，该病的发生给养殖户带来了巨大的经济损失。为了提高鸭黄病毒检测的准确性和高效性，本研究拟建立一种能用于该病检测的一步法荧光定量PCR方法，为鸭黄病毒的流行病学、致病机理及诊断与防治等方面提供技术平台。

1 材料与方法

1.1 材料

鸭黄病毒HBJL株为动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室保存，该毒株用8～12日龄的鸭胚增殖。

1.2 主要试剂

TaqDNA聚合酶、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、DEPC、dNTPs、Mg2+均购自宝生物工程（大连）有限公司；Trans DNA Marker Ⅲ购于北京全式金生物科技有限公司；Viral RNA Mini Kit（50）购自上海华舜生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探针 根据鸭黄病毒HBJL株NS5基因序列（GenBank No. JF423123），使用Primer Primier 5软件设计1对引物和1条探针。上游引物（DFV-F）序列为：5′-atgaataaggtggtgaaggtaatgc-3′，下游引物（DFV-R）序列为：5′-cagattcgtgaaagtgttgagagc-3′，荧光探针（DFV-P）序列为：5′-catgactgttttcccatcacgtcccgg-3′，荧光探针DFV-P 5′端标记的是荧光报告基团FAM，3′端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。引物和探针均由上海博亚生物技术有限公司合成，TE中溶解，-20 ℃保存备用。引物DFV-F和DFV-R用于荧光定量扩增，目的片断长130 bp。

1.3.2 标准品的制备及病毒含量的检测 将毒株HBJL接种8～12日龄的鸭胚后，观察5～7 d收集死亡鸭胚的胚体、尿囊膜和尿囊液，并混合研磨。冻融3次后12 000 r/min离心3次取上清即为病毒液，测定病毒含量为103.7 ELD50（0.2 mL）（Median embryo lethal dose，ELD50），将病毒原液稀释为原来的1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6后接种8～12日龄鸭胚，每个稀释度接种5枚鸭胚。然后将病毒上清液用Viral RNA Mini Kit提取RNA，加DEPC水溶解RNA后，-70 ℃保存作为标准品备用。

1.3.3 一步法荧光定量PCR反应条件的优化 用矩阵法对荧光定量PCR的引物浓度、探针浓度、Mg2+浓度等进行筛选优化，以得到最佳的荧光定量PCR反应条件。

荧光定量检测的循环条件为：42 ℃ 20 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 50 s，50个循环。把荧光检测的程序设定在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为530 nm，自动计算出Ct值并给出定量结果。

1.3.4 荧光定量PCR与常规PCR敏感性比较试验 为了比较荧光定量PCR与常规PCR的敏感性，用10倍系列稀释的标准品（病毒含量为103.7、102.7、101.7、100.7、10-0.3、10-1.3、10-2.3 ELD50）为定量检测模板，用动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室自行建立的常规PCR及荧光定量PCR对检测模板进行检测，将PCR产物的电泳结果作为常规PCR的敏感性与荧光定量PCR检测的敏感性进行分析比较[1]。

1.3.5 特异性试验 为验证本方法的特异性，同时提取禽流感、禽白血病、禽大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、新城疫、减蛋综合征病鸭鸭胚的RNA，在相同条件下进行荧光定量PCR，观察反应的特异性。

1.3.6 重复性试验 取鸭黄病毒浓度为102.7、101.7、100.7 ELD50作为检测模板，用荧光定量PCR方法进行组间重复性检测，并对检测结果进行统计学分析。

1.3.7 人工感染鸭胚的检测 用鸭黄病毒HBJL株的病毒尿囊液1∶1 000稀释后，卵黄囊接种8～12日龄鸭胚30枚，0.2 mL/只，另设接种生理盐水为阴性对照组，连续观察5 d后收集鸭胚，弃去24 h内死亡的鸭胚，取尿囊液及胚体胚膜，加生理盐水研磨后，冻融3次，离心取上清液；阴性对照组的鸭胚在观察5 d后取尿囊液及胚体胚膜，研磨后冻融3次离心取上清液。将所有待检上清液提取RNA应用荧光定量PCR方法检测，同时用常规PCR检测，比较两者检测结果。

2 结果与分析

2.1 荧光定量PCR反应条件的优化

反应总体系20 μL，其组成为： 10倍系列稀释的标准品或待测样品的RNA 10 μL，10×PCR Buffer 2 μL，50 mmol/L MgCl2 1.6 μL， 25 mmol/L dNTPs 0.4 μL， 500 U/μL M-MLV酶0.2 μL ，Taq酶0.2 μL，上游引物DFV-F和下游引物DFV-R各0.8 μL，荧光探针DFV-P 为0.8 μL，去离子水补齐。

2.2 标准曲线的建立

以10倍系列稀释的标准品（病毒含量为103.7～10-2.3 ELD50）为检测模板，得到动力学曲线图1和标准曲线图2。如图1所示，横坐标代表循环次数，纵坐标代表荧光强度，图中平行横坐标的直线代表荧光阀值，曲线①～⑦分别是7个稀释度的标准品的动力学曲线；图2为标准品10倍稀释进行荧光定量结果的数据经分析后自动生成的标准曲线，方程为y=-4.280 9x+33.788，R2≈0.99。从图1可知，建立的荧光定量PCR检测的最低病毒含量为10-0.3 ELD50，即10-4稀释度。由图2可知，模板浓度与Ct值之间呈良好的线性关系。

2.3 特异性及与常规PCR敏感性比较

经荧光定量PCR检测，鸭黄病毒HBJL株均显示出良好的扩增反应曲线，分析结果表明，扩增产物单一。与常规PCR比较，荧光定量PCR方法能检测到10-4稀释度的标准品，而常规PCR只能检测到10-2稀释度的标准品（图3），结果表明，荧光定量PCR的敏感性是常规PCR的100倍左右。

特异性试验中鸭黄病毒HBJL株呈典型扩增曲线，而其他禽流感、禽白血病、禽大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、新城疫、减蛋综合征均为阴性。

2.4 重复性试验

取3份不同病毒水平的鸭黄病毒样品进行组间重复性检测（表1），由表1可知，重复性检测的组间变异系数（CV）分别为4.4%、4.8%、3.7%，均小于5%，证明该检测方法具有很好的重复性。

2.5 人工感染鸭胚的检测

用本研究建立的荧光定量PCR方法从接种的30枚鸭胚中能检测到鸭黄病毒。而常规PCR仅能从死亡的21枚鸭胚中检测到阳性。结果表明荧光定量PCR的敏感性明显高出常规PCR。

3 讨论

鸭黄病毒最早于2010年在中国浙江、福建、江苏等地种鸭、蛋鸭场大范围流行，该病的发生引起国内禽病工作者的高度关注，曹贞贞等[2]最先对该病进行了报道，将其称为鸭出血性卵巢炎，与此同时，腾巧泱等[3]也成功从华东地区爆发的疫情分离到该病的病原。通过一系列的研究已证实，该病原是一种与坦布苏病毒亲缘关系非常密切的黄病毒。黄病毒为黄病毒科黄病毒属，是一种单股正链的RNA病毒[4]。在相关的报道中，以感染人和其他哺乳动物为主，如乙型脑炎病毒、登革热病毒、猪瘟病毒等。但在2010年，中国首次突发大面积因该病原感染而造成的蛋鸭产蛋下降甚至死亡的疫情，给全国的养鸭业造成了极为严重的经济损失，由于没有相应的技术储备和特异性生物制品[5]，使得疫情得不到及时地确诊和控制。

针对该病原的检测还没有一个很好的方法，本研究建立了一步法荧光定量PCR诊断方法。荧光定量PCR方法是20世纪90年代中期发展起来的实时定量检测特定核酸的技术，是在普通PCR的基础上增加了一条具有高特异性的荧光标记DNA探针，通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现对核酸进行定量检测的[6]。是目前国际上用在病毒检测上最先进的检测方法之一，综合PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显像技术等于一体，具有很高的检测灵敏度[7]；靶序列由引物和探针双重控制，特异性高，与普通PCR扩增技术相比具有无法比拟的优点。本研究针对鸭黄病毒的特异性序列进行比对分析设计了一对特异性引物和一条特异TaqMan探针，并对反应体系进行了优化，建立了一种检测鸭黄病毒的荧光定量PCR方法，其敏感度是常规PCR的100倍左右，可对大批量可疑样品在2 h内做出定性检测，检测结果直接读出，PCR污染的机率大大降低。为鸭黄病毒致病机理、诊断防治等基础研究提供有效的手段。

参考文献：

[1] 张蓉蓉，温国元，罗青平，等.一种黄病毒引起鸭产蛋下降的诊断报告[J].湖北农业科学，2011，50（19）：4010-4012，4017.

[2] 曹贞贞，张 存，黄 瑜，等.鸭出血性卵巢炎的初步研究[J].中国兽医杂志，2010，46（12）：3-6.

[3] 腾巧泱，颜丕熙，张 旭，等.一种新的黄病毒导致蛋鸭产蛋下降及死亡[J]. 中国动物传染病学报，2010，18（16）：1-4.

[4] FAUQUET C M. Virus taxonomy： Classification and nomenclature of viruses： eighth report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses[M]. San Francisco： Elsevier Academic Press，2005.

[5] 赵圆圆，李传峰，朱良强，等.鸭产蛋下降-死亡综合征的临床诊断与病原的初步鉴定[J].扬州大学学报（农业与生命科学版），2011，32（3）：11-14.

[6] 朱 捷，杨成君，王 君.荧光定量PCR技术及其在科研中的应用[J].生物技术通报，2009（2）：73-76.

[7] 白兴华，冯 力，陈建飞，等.猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].畜牧兽医学报，2007，38（5）：476-481.