亚硒酸钠、硫酸镁对石英致细胞因子释放和羟脯氨酸合成影响的体外研究

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摘要： ［目的］ 观察亚硒酸钠（Na2SeO3）、硫酸镁（MgSO4）对二氧化硅（石英）致巨噬细胞（RAW264.7）释放肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-1（IL-1）的单独拮抗作用以及对人胚肺成纤维细胞羟脯氨酸（Hyp）合成水平变化的单独以及联合拮抗作用。 ［方法］ 对数生长期的RAW264.7细胞，调整浓度为2×105个/ml。在染200 mg/L石英同时单独加入不同浓度Na2SeO3、MgSO4溶液，24 h后测定培养液中TNF和IL-1水平，并取培养液与人胚肺成纤维细胞共同培养，48 h后测定人胚肺成纤维细胞培养液中Hyp含量。另外，在染石英同时联合加入不同浓度的Na2SeO3和MgSO4溶液，培养24 h后取培养液与人胚肺成纤维细胞共同培养，48 h后测定其中的Hyp含量。 ［结果］ ①与石英组比，Na2SeO3对RAW264.7细胞释放TNF-α无明显影响，MgSO4可以显著降低TNF-α的活性（P < 0.05），其中以1.0 μmol/L MgSO4的效果更为明显。②与石英组比，一定剂量的Na2SeO3、MgSO4可以降低IL-1的活性，其中以0.5 μmol/L Na2SeO3和2.0 μmol/L MgSO4的效果最好（P < 0.05）。③与石英组比，一定剂量的Na2SeO3、MgSO4可以显著降低人胚肺成纤维细胞Hyp合成水平（P < 0.05），其中以2.0 μmol/L Na2SeO3和2.0 μmol/L MgSO4的效果最明显。④与石英组比，一定剂量的Na2SeO3与MgSO4联合可以降低人胚肺成纤维细胞Hyp合成水平，其中以2.0 μmol/L Na2SeO3和2.0 μmol/L MgSO4联合作用效果最明显（P < 0.05）。 ［结论］ 一定剂量的MgSO4对石英致巨噬细胞释放TNF-α具有拮抗作用；一定剂量的Na2SeO3和MgSO4对石英致巨噬细胞释放IL-1具有单独拮抗作用，对人胚肺成纤维细胞Hyp合成水平具有单独及联合拮抗作用。

关键词：亚硒酸钠；硫酸镁；石英；巨噬细胞；人胚肺成纤维细胞；肿瘤坏死因子；白介素-1；羟脯氨酸

A Study about the Effect of Sodium Selenite and Magnesium Sulfate on Cytokine Releasing and the Hydroxyproline Synthetizing Induced by Quartz CHEN Guo-yin，TAN Wei-jun*，YIN Hai-rong，HE Zheng，SUN Yan（School of Public Health，Southeast University，Nanjing 210009，China）

Abstract：［Objective］ To investigate the effect of sodium selenite and magnesium sulfate which were used separately on TNF-α and IL-1 releasing from RAW264.7 macrophage treated with quartz and which were used separately and/or combined on the hydroxyproline synthetizing in human embryonic lung fibroblast also treated with quartz. ［Methods］ RAW264.7 and human embryonic lung fibroblast were cultured at 37℃ with 5% carbon dioxide. RAW264.7 were prepared during the growth period of logarithm in the concentration of 2×105 /ml and poisoned with quartz（200 mg/L），at the same time sodium selenite and magnesium sulfate in different concentration were added separately. After 24 hours，TNF-α and IL-1 in RAW264.7 culture fluid were measured .Then the RAW264.7 culture fluid and the human embryonic lung fibroblast were cultured together. After 48 hours，the hydroxyproline in human embryonic lung fibroblast culture fluid were measured. In addition，when the RAW264.7 was poisoned with quartz，sodium selenite and magnesium sulfate were added together simultaneously. Then followed the same procedure as above mentioned and the hydroxyproline in human embryonic lung fibroblast culture fluid were measured too after 48 hours. ［Results］ ①Magnesium sulfate could reduce TNF-α releasing，with the middle dose（1.0 μmol/L）most effective，but sodium selenite could not.②Sodium selenite and magnesium sulfate both could reduce IL-1 releasing，with the low dose（0.5 μmol/L）and high dose（2.0 μmol/L）most effective. ③Sodium selenite and magnesium sulfate used separately could reduce the hydroxyproline synthetizing，with the high dose（2.0 μmol/L）most effective.④Sodium selenite and magnesium sulfate used together can reduce hydroxyproline synthetizing，with both at the dose of 2.0 μmol/L most effective. ［Conclusion］ The specified dose of magnesium sulfate weakened the toxicity of quartz on TNF-α releasing in RAW264.7，but sodium selenite didn’t. The specified dose of sodium selenite and magnesium sulfate used together weakened the toxicity of quartz on IL-1 releasing in RAW264.7. Moreover，the specified dose of sodium selenite and magnesium sulfate used separately and/or combined could weaken the toxicity of quartz on the hydroxyproline synthetizing in human embryonic lung fibroblast in vitro.

Key Words：sodium selenite；magnesium sulfate；macrophage；quartz；human embryonic lung fibroblast；TNF-α；IL-1；hydroxyproline

石英粉尘进入机体后可引发巨噬细胞（AM）自由基的产生和脂质过氧化反应。受刺激的AM还能释放大量的细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF-α）、血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGF-β）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、白介素-1（IL-1）、白介素-8（IL-8 ）等。在众多细胞因子作用下，肺成纤维细胞大量增生，胶原代谢紊乱，细胞外基质沉积，最终导致了肺纤维化。硒、镁是人体必需的元素，参与机体多种酶的组成，涉及生物体内的细胞代谢，具有重要的生理功能。研究证实，机体内硒、镁等元素和矽肺的发生、发展关系密切［1，2］。本研究主要探讨Na2SeO3、MgSO4单独对石英致AM释放TNF-α和IL-1的拮抗作用以及对人胚肺成纤维细胞羟脯氨酸（Hyp）合成水平变化的单独以及联合拮抗作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

二氧化硅（SiO2）采用标准石英粉尘，由中国预防医学科学院提供，游离SiO2的含量> 97%，粉尘粒径

1.2 仪器及器械

CO2培养箱（Heal Force Development公司，香港产，型号：BB5060UV）；倒置显微镜（Olympus公司，日本产，型号：CK40-F200）；血细胞计数器；离心机（型号：LD5-2A，北京医用离心机厂）；净化工作台（SW-CJ-2F，中国苏州）；可见分光光度计（上海第三分析仪器厂产品，型号：722）；放射免疫计数器（中国科技大学实业总公司产品，型号：GC-911-γ）

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 RAW264.7巨噬细胞株和人胚肺成纤维细胞株购自上海细胞研究所。细胞分别用DMEM和MEM培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。每日用倒置显微镜观察细胞生长情况，待细胞长满至80%左右单层时，用0.25%胰蛋白酶溶液进行消化、传代，取生长良好的细胞进行实验。

1.3.2 实验分组 取生长良好的RAW264.7细胞消化，以2×105个/ml的密度接种到24孔板中，经24 h培养后，分成：①阴性对照组（生理盐水）；②阳性对照组（石英 200 mg/L）；③Na2SeO3单独作用组：含200 mg/L 石英，Na2SeO3浓度分别是0.5、1.0、2.0 μmol/L；④MgSO4单独作用组：含200 mg/L 石英，MgSO4浓度分别是0.5、1.0、2.0 μmol/L。24 h后取细胞培养液0.5 ml测TNF-α、IL-1。另取0.1 ml培养液与人胚肺成纤维细胞共同培养，48 h后测定细胞培养液中Hyp含量；⑤Na2SeO3与MgSO4联合作用组：每组内含200 mg/L石英外，Na2SeO3与MgSO4各按上述3种浓度采用正交表L9（34）的设计，共9个浓度组。37℃，5% CO2培养箱培养，24 h后取细胞培养液0.1 ml与人胚肺成纤维细胞共同培养，48 h后测定细胞培养液中Hyp含量，操作严格按照说明书进行。

1.3.3 统计分析 应用SAS 8.1软件中的完全随机设计资料方差分析及正交实验设计方差分析进行数据处理。

2 结果

2.1 Na2SeO3与MgSO4单独作用对石英致RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-1的影响

表1可见，石英粉尘引起了RAW264.7中TNF-α和IL-1的含量增加，与阴性对照组比较，具有统计学意义（P < 0.05）。不同剂量Na2SeO3单独作用后IL-1含量均有所下降，其中以加入0.5 μmol/L 的Na2SeO3 对IL-1释放的拮抗作用效果最明显（P < 0.05），但Na2SeO3各剂量组对TNF-α的拮抗作用不明显。而不同剂量MgSO4单独作用后TNF-α和 IL-1含量均有所下降，其中分别以加入1.0、2.0 μmol/L MgSO4的作用效果最明显。

2.2 Na2SeO3与MgSO4单独作用对石英致成纤维细胞Hyp合成水平的影响

表2可见，石英粉尘可引起人胚肺成纤维细胞Hyp合成含量增加，与阴性对照组比较，具有统计学意义（P < 0.05）。与阳性对照组比较，不同剂量Na2SeO3单独作用后Hyp合成水平下降，其中以加入1.0、2.0 μmol/L Na2SeO3的拮抗作用最明显（P < 0.05），而不同剂量MgSO4单独作用后人胚肺成纤维细胞Hyp合成水平有显著下降，其中以加入2.0 μmol/L MgSO4的效果最明显。

2.3 Na2SeO3与MgSO4联合作用对石英致成纤维细胞Hyp合成水平的影响

表3可见，石英粉尘引起了人胚肺成纤维细胞Hyp合成水平增加，与阴性对照组比较，具有统计学意义（P < 0.05）。与阳性对照组比，Na2SeO3、MgSO4联合可以显著降低人胚肺成纤维细胞Hyp合成水平，其中以2.0 μmol/L Na2SeO3和2.0 μmol/L MgSO4联合作用效果最明显。

2.4 Na2SeO3与MgSO4联合作用对石英致成纤维细胞Hyp合成影响的交互作用

由Na2SeO3与MgSO4联合作用对石英致成纤维细胞Hyp合成水平变化的影响的方差分析结果可知，Na2SeO3和MgSO4的交互作用具有统计学意义（P < 0.05）（表4）。

3 讨论

近年来，多数学者认为石英粉尘引发肺泡AM内自由基链式反应，导致肺泡AM损伤。受矽尘刺激的AM损伤后能够释放大量的细胞因子，在众多细胞因子作用下，肺成纤维细胞大量增生，胶原代谢紊乱，细胞外基质沉积，最终导致了肺纤维化［3］。除受矽尘刺激的AM分泌大量炎症因子作用于肺成纤维细胞，使之增生、活化外，自由基还可直接作用于成纤维细胞导致纤维化［4］。

TNF-α是一种细胞毒因子，作为前炎症细胞因子可增加中性粒细胞和嗜酸粒细胞的功能，并刺激其产生超氧化物，释放溶酶体酶，对其周围细胞产生毒性作用，它还介导其他细胞因子和炎症因子的表达，并能刺激成纤维细胞增殖［5］。而IL-1主要来源于单核巨噬细胞，在肺纤维化的发病中，它既可介导肺泡炎症和损伤，又可促进修复及过度修复，引起间质纤维化；它还可上调黏附分子的分泌，使白细胞进入肺间质，促进肺成纤维细胞产生胶原和氨基多糖。在肺纤维化的动物模型和特发性肺间质纤维化病人的肺泡AM和支气管肺泡灌洗液中，均可检测出高水平的IL-1。

研究证实，微量元素硒、镁在体外具有拮抗石英粉尘细胞毒性、清除自由基、防止脂质过氧化等作用［6，7］。硒是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）中起氧化还原作用的惟一元素。同时，硒与硒化合物在消除自由基、抗脂质过氧化方面发挥重要作用，它可清除脂质过氧化自由基中间产物，分解脂质过氧化物，修复由自由基引起的硫化物分子损伤，在自由基破坏生命物质前将其清除或转变为稳定化合物，还能催化巯基化合物作为保护剂的反应。有研究表明，镁可减少缺血后再灌注心肌乳酸脱氢酶的漏出，维持GSH-Px的活性，减少氧自由基的产生，降低心肌组织中的丙二醛（MDA）含量，起到抗脂质过氧化而保护心肌细胞的作用［8-10］，Mg2+对内皮细胞及培养乳鼠心肌细胞羟自由基诱导的脂质损伤有保护作用［11，12］，镁还作为钙的拮抗剂减少自由基的生成，减轻膜脂质过氧化反应［13］。

本次研究结果表明，石英粉尘与RAW264.7细胞共同培养，RAW264.7细胞释放TNF-α、IL-1的量明显增加。加入不同剂量Na2SeO3单独作用后IL-1含量均有所下降，对IL-1释放具有一定的拮抗作用；而对TNF-α无明显作用。不同剂量MgSO4单独作用后TNF-α和 IL-1含量均明显下降。Na2SeO3、MgSO4单独以及联合作用均可以显著降低人胚肺成纤维细胞Hyp合成水平（P < 0.05）。本次实验结果提示一定剂量的Na2SeO3、MgSO4可以拮抗RAW264.7细胞释放IL-1以及人胚肺成纤维细胞Hyp的合成水平，一定剂量的MgSO4还可以拮抗RAW264.7细胞释放TNF-α。

参考文献：

龚建新，孙晓武，石南宁，等.矽肺高危人群二种资料早期判别的比较［J］.中国工业医学杂志，1999，12（6）：338-340.

刘安生，施晓红，刘大智，等.测定头发中微量元素筛选0+期接尘工人的研究［J］.预防医学情报杂志，1999，15（1）：3-5.

CASTRANOVA V，PORTER D，MILLECCHIA L，et al. Effect of inhaled crystalline silica in a rat model：time course of pulmonary reactions［J］. Mol Cell Biochem，2002，234-235（1-2）：177-184.

GABOR S，ANCA Z，ZUGRAVU E. In vitro action of quartz on alveolar macrophage lipid peroxides［J］. Arch Environ Health，1975，30（10）：499-501.

邵长周，陈小东，蔡映云.细胞因子在肺纤维化形成中的作用［J］.国外医学内科学分册，2001，28（11）：484 -485.

何整，谈伟君，陈国银，等.锰硒联合对二氧化硅致肺泡巨噬细胞功能的影响［J］.中国公共卫生，2006，22（增刊）：5-6.

谈伟君，季晖，何整，等. 硒和镁拮抗二氧化硅致肺泡巨噬细胞氧化损伤的研究［J］.东南大学学报，2006，25（4）：272-274.

齐志敏，王倩，张英杰，等.大鼠心脏缺血再灌损伤与葡萄糖酸镁的保护作用［J］.中国临床康复，2005，9（27）：51-53.

时安云，徐海.镁对缺血后在灌注心肌的保护作用［J］.中国病理生理杂志.1996，12（2）：126-129.

刘华章，詹澄扬.镁对却血后再灌注心肌脂质过氧化物的影响［J］.广州药学院学报，1998，14（1）：18-19.

吕晓华，王瑞淑.镁对内皮细胞脂质过氧化和抗氧化酶的影响［J］.营养学报，2001，23（3）：250-253.

李洁，徐标，何家声.镁离子对培养乳鼠心肌细胞羟自由基损伤的保护作用［J］.铁道医学，1999，27（6）：373-375.

吴俭，金国强，赵玲.缺氧缺血新生大鼠脑组织SOD、MDA和NO的变化及硫酸镁的保护作用［J］.江西医学院学报，2002，42（1）：49-51.

（收稿日期：2006-10-30）

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