鸡柔嫩艾美尔球虫基因重组疫苗的研究现状
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摘要：鸡球虫病是鸡主要的寄生虫病，柔嫩艾美耳球虫是毒力最强的球虫病病原，给养鸡业造成巨大的经济损失，防治该病的疫苗有强毒苗、弱毒苗和基因工程苗。由于活疫苗有自身无法克服的缺点，基因工程疫苗受到极大重视，特别是重组表达亚单位疫苗和重组DNA疫苗，论文对这两种基因重组疫苗的研究现状进行综述。
关键词：鸡柔嫩艾美耳球虫；疫苗；基因重组苗
中图分类号： S859.797 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2013）-08-82-2
鸡球虫病是由属于顶复门、孢子虫纲、真球虫目、艾美耳科、艾美耳属的原虫寄生于鸡肠道引起的疾病，由于其造成雏鸡大量死亡，耐过的鸡只因为消化功能障碍，饲料转化率下降，生长发育缓慢而出现生产性能下降问题，给养鸡业造成巨大损失。感染鸡的球虫主要有柔嫩艾美耳球虫（E.tenella），堆型艾美耳球虫（E.acervulina），早熟艾美耳球虫（E.praecox），巨型艾美耳球虫（E.maxima），布氏艾美耳球虫（E.brunetti），毒害艾美耳球虫（E.necatrix）以及和缓艾美耳球虫（E.mitis）[1]。其中，柔嫩艾美耳球虫虫株是该属球虫中毒力最强、危害性最大的虫种，并且与其他球虫株之间几乎无交叉反应，给养鸡业带来极大的危害，据Allen报道全世界每年因此病造成经济损失超过80亿[2]。
1 重组表达亚单位疫苗
基因重组表达亚单位疫苗是利用DNA重组技术，将编码E.tenella保护性抗原基因导入受体细菌或者细胞，使其在受体中高效表达，分泌保护性抗原肽链，然后提取保护性抗原肽链，加入佐剂即成。基因重组表达亚单位疫苗的候选基因有5401、SO7、3-1E、 MZ5-7和表面抗原SAG5、SAG10、SAG13、SAG 14等。
H. D. Danforth[3]等于1989年开启了对鸡球虫基因重组表达亚单位疫苗的篇章，他们把柔嫩艾美耳球虫子孢子表面抗原5401导入到大肠杆菌中与β-galactosidase 融合表达，添加弗氏完全佐剂配制疫苗，经该重组疫苗皮下免疫一次的鸡在攻毒后的损害评分明显低于对照组，增重效率则明显高于对照组。Du Aifang [4]等，使用编码艾美耳球虫5401抗原转入到致弱沙门氏菌中制备的重组疫苗，试验表明最多有55%的保护力。
SO7是位于子孢子折光体上的一种抗原。M. S. Crane[5]等的研究发现重组表达的E. tenella SO7抗原免疫鸡只，不但能保护受到同源株攻毒的鸡，同样也能保护受到E. acervulina， E. maxima 和 E. necatrix攻毒的鸡。Christian Klotz[6]等， 用SO7抗原与两种不同的真核表达载体构成的重组疫苗，做免疫保护性试验，均能够减少排卵量，具有部分保护力，而且对其他球虫也有一定的交叉保护，说明SO7抗原可以作为候选疫苗。
麦博等[7]将E.tenella表面抗原SAG10做原核表达后将重组蛋白以lOOug/只肌肉注射免疫雏鸡，攻虫后观察免疫效果，免疫组抗球虫指数为152.13。说明重组表达的EtSAGl0可诱导雏鸡产生一定的抗球虫免疫保护。E.tenella表面抗原SAG13和SAG14[8]，SAG2和SAG7[9] SAG5[10]做原核表达，将可溶性蛋白免疫雏鸡，攻毒后检测其重组蛋白的免疫保护效果，结果表明，这些重组表达蛋白均有一定的抗球虫保护力。
Millter[11]等于1989年用抗Etenella子抱子28KD的单抗Mabl209从cDNA文库中筛选出GX3262基因，表达的融合蛋白分子量为115kDa，试验表明用该重组抗原免疫幼龄肉鸡对感染艾美耳球虫卵囊产生明显的部分保护作用。
B. M. Subramanian[12]等的研究发现一个来自于E. tenella 微线体的能激发宿主鸡的体液和细胞免疫反应的抗原EtMIC1，重组表达的EtMIC1能提供受试鸡部分的免疫保护。
Ralf.Hosse[13]等首次克隆表达出柔嫩艾美耳球虫的89kDa亲环蛋白 EtCTP89，在E.tenella整个生活史中表达，其从CsA到Cyps具有紧密联系，研究表明亲环蛋白A具有抗球虫作用。Nishinaka S[14]等从母系的无胸苷激酶活性的R27H1和 R27H4与鸡的B细胞系MuH1 和MuH4融合制备单克隆抗体，研究表明能产生IgG。Clarke Lorraine E等克隆EtHL6抗原，该抗原能在Eimeria tenella的子孢子和第二代裂殖子阶段表达，结果表明具有一定的保护作用。
2 重组DNA疫苗
重组DNA疫苗是将一种或者几种抗原基因重组到表达载体，直接或经包装注入体内表达出相应抗原，诱导机体产生免疫应答。
X. Ding [15]等用E. tenella微线体抗原基因EtMIC-2构建的DNA疫苗载体进行卵内鸡胚免疫，结果表明其能提高雏鸡攻毒后10天和17天的抗体水平，同时排卵量下降，增重提高。
3-lE是E.tenella子抱子与裂殖生殖阶段的表面抗原，氨基酸序列全长1086bp，含有一个由170个氨基酸组成的开放阅读框架。Song [16]克隆3-lE基因构建 pMPI3-3-lE重组质粒 ，插入到pBK-CMV载体中 ，以不同的免疫剂量和免疫方式免疫1日龄雏鸡 ，14日龄时功毒， 10d后，检测机体的抗体，结果表明不管何种接种方式 ，均能检测到最高的循环抗体水平。说明3-lE基因能够促进机体免疫系统产生免疫保护作用。D. Ma [17]用共表达3-1E和IL-15的DNA疫苗载体免疫试验鸡的结果表明其免疫保护效果（用ACI评价）比仅表达3-1E抗原的DNA疫苗的保护效果更好。Geriletu [18]用共表达E.tenella抗原基因MZ5-7和IL-17的DNA疫苗载体免疫试验鸡，7天后鸡脾细胞的IL-2和IFN-γ表达量上升，攻毒后免疫组的抗球虫指数也明显高于对照组，而且共表达IL-17的DNA疫苗比仅表达MZ5-7抗原的DNA疫苗的保护效果更好。徐守振[19]增出有3-l E抗原基因和鸡IFN基因融合克隆到真核表达载体 proVAX中构建双价融合表达质粒 proIE。将proIE于14、21日龄免疫AA肉鸡，28日龄观察免疫保护效果。结果显示， proIE双价融合DNA疫苗具有增强免疫保护作用，可显著降低粪便中的卵囊排出量（P
TA4 是柔嫩艾美耳球虫通过二硫键连接5kDa和17kDa两条多肤形成的子孢子的一种表面糖蛋白。S. Q. Wu[20]的研究发现表达E.tenella抗原基因TA4的DNA疫苗pcDNA3.1-TA4和pcDNA3.1-Et1A-TA4经肌肉免疫能提供试验鸡部分免疫保护效果，抗球虫指数（ACI）达到160。Xu Qianming [21]用嵌合有艾美耳球虫TA4和IL-2基因的联合表达疫苗诱导鸡体对球虫病的免疫力，结果表明TA4基因是有效的疫苗表达抗原，该抗原和细胞因子联合表达能增强DNA疫苗的免疫力，是一个不错的方法。
λMZ5-7是在第二代裂殖子阶段表达的一种分泌性蛋白（MZP）。秦睿玲[22]将λMZ5-7连接到pVAX载体构建重组质粒pVAX-Mzp5-7，用该重组质粒肌肉注射机体内表达，免疫试验表明该质粒对鸡柔嫩艾美球虫的攻击有较好的免疫保护作用。
L Yang [23]克隆广东株Eimeria tenella的子孢子折光体抗原Etp28基因与AcMNPV-OCC（-））构建重组表达体GST-6xHis-Etp28免疫鸡只，实验表明具有部分保护作用，可以作为候选疫苗。Yang Guilian [24]，用重组鸡痘病毒表达艾美耳球虫菱形基因能够诱导免疫反应，证明有部分保护作用。D.G..J. Breed[25]， 筛选出4段不同的基因片段用于免疫鸡只，都能诱导出强烈的T细胞反应，其中有一段分子量是26到30kDa的基因片段，试验表明能够极大的减少盲肠病变。Alireza Talebi[26]，用编码抗原的基因合成多肽疫苗用于预防鸡只，分别用Eimeria acervulina 和Eimeria tenella 功毒，结果是能产生很高水平的抗体，细胞内反应具有部分交叉免疫保护作用。
3 展望
从80年代开始研究鸡球虫基因工程疫苗至今，取得了很大的成果。艾美耳球虫重组疫苗研究表明以这些抗原基因制备的亚单位疫苗和DNA疫苗对鸡球虫攻毒具有一定的免疫保护作用，但所有这些研究中的重组疫苗都还达不理想的保护效果，离临床应用还有较大距离。艾美尔球虫的基因工程重组疫苗研究之所以至今未有突破性进展，我们分析主要有三方面的原因：其一，目前对艾美尔球虫重组疫苗的研究大都是基于偶然发现的一些单个抗原基因进行的一些试验性免疫效果研究，缺乏对艾美耳球虫所有抗原的系统化研究基础。其二，由于球虫的生活史比较复杂，球虫发育的每一阶段都具有免疫原性，对球虫感染诱发保护性免疫起关键作用的可能不只一种抗原，可能需要多种抗原的共同作用才能诱发保护性免疫反应。其三，对球虫感染宿主的机制现在仍然不清楚，这也是制约柔嫩艾美耳球虫疫苗研究的一大难题。随着分子生物技术的不断发展和对球虫基因的研究不断深入，最终能研究出高效的基因重组疫苗。
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作者简介：许李丽（1987—），女，重庆市永川区人，就读于西南大学动物科技学院，预防兽医学硕士研究生。