表阿霉素免疫纳米微粒的制备及体外抗肿瘤作用研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇表阿霉素免疫纳米微粒的制备及体外抗肿瘤作用研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

[摘要] 目的 制备表阿霉素免疫纳米微粒，观察其抗体活性、体外释药及体外抗肿瘤作用。 方法 利用聚电解质复合法合成载表阿霉素纳米微粒（E-ADM-NPs），化学交联法合成载表阿霉素的抗血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）单克隆抗体纳米微粒。ELISA法检测表阿霉素单克隆抗体纳米微粒（E-ADM-Ab-NPs）的抗体活性，紫外分光光度计测定其体外释药量，MTT法检测其对人肝癌细胞的体外杀伤效应。 结果 E-ADM-Ab-NPs的平均粒径为（190±21） nm，抗体活性保存良好；体外释药试验表明，E-ADM-Ab-NPs具有缓释特性，10 d累积释药量可达93.46%；E-ADM的体外杀伤效应在1～6 d呈时间依赖性，而E-ADM-Ab-NPs则在1～10 d均呈时间依赖性，6 d时两者的杀伤效应均呈剂量依赖性，且两者间差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 E-ADM-Ab-NPs具有药物缓释效应和免疫活性，可延长表阿霉素（E-ADM）对人肝癌细胞的有效作用时间，且并未影响E-ADM的生物学活性。

[关键词] 表阿霉素；载药纳米微粒；聚电解质复合法；缓释作用；血管内皮生长因子；肝癌

[中图分类号] R730.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）06（a）-0077-03

载药纳米微粒因其具备良好的生物相溶性、单核吞噬细胞系统靶向性、表面可修饰性和缓释性等特点，日益成为肿瘤靶向治疗领域研究的热点[1-2]，但如何改良载药纳米微粒的制备条件、如何增加携带肿瘤特异性单克隆抗体的稳定性等问题仍有待进一步完善提高。本研究在前期研究中以海藻酸钠和阳离子瓜尔胶为载体材料，利用操作简便且反应温和的聚电解质复合法制成载表阿霉素纳米微粒（E-ADM-NPs）[3]。本研究将进一步探讨抗血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）单克隆抗体与E-ADM-NPs的交联，并观察表阿霉素单克隆抗体纳米微粒（E-ADM-Ab-NPs）的抗体活性、体外释药及对人肝癌细胞株的体外杀伤效应，为荷瘤动物体内实验研究提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

盐酸表阿霉素（法玛西亚公司，批号56390-09-1）；海藻酸钠（温州东升试剂厂，批号9005-38-3）；阳离子瓜尔胶（美国Economy公司，批号65497-29-2）；抗VEGFR2单克隆抗体（美国Biodesign公司，批号A00355）；碳化二亚胺（EDC）（美国Pierce公司，批号CB4403030）；噻唑蓝（MTT）（Sigma公司，批号050609）；人肝癌Bel 7402细胞株（由中科院上海细胞生物研究所提供）。

1.2 E-ADM-Ab-NPs的制备及抗体活性检测

依据前期研究结果[3]，利用聚电解质复合法制备E-ADM-NPs和未载药NPs。称取E-ADM-NPs和未载药NPs各10 mg，分别与2 mg 抗VEGFR2单抗溶于pH值7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中，缓慢加入5 mg EDC，4℃条件下搅拌2 h后静置过夜。将所得溶液离心后用蒸馏水洗涤3遍，冷冻干燥即可制得E-ADM-Ab-NPs和未载药Ab-NPs。利用动态光散射粒径分析仪测定E-ADM-Ab-NPs的粒径分布，扫描电镜下观察其形态。参考文献[4]利用酶联免疫测定法（ELISA）对E-ADM-Ab-NPs中抗VEGFR2单抗的活性进行检测，以450 nm波长处的吸光度值（OD450）计算抗体活性保存率，抗体活性保存率=（E-ADM-Ab-NPs OD450/抗VEGFR2单抗OD450） ×100%。

1.3 E-ADM-Ab-NPs的体外释药试验

称取E-ADM-Ab-NPs粉末20 mg装入透析袋内封严，置于装有100 mL PBS（pH值7.4）的锥形瓶中，在（37.0±0.5）℃的水平恒温振荡器内进行动态透析（频率为60 r/min）。分别于0.5、1、4、8、16、24、48、96、144、192、240 h后吸取15 mL PBS作为样品，同时补充相同体积的新鲜PBS。测定样品在477 nm波长处的吸光度值，依据标准曲线方程计算不同时间点E-ADM的释放量，绘制E-ADM-Ab-NPs体外释药曲线。

1.4 E-ADM-Ab-NPs的体外抑瘤试验

取对数生长期的人肝癌Bel 7402细胞悬液（1×105个/mL）接种于96孔细胞培养板，每孔90 μL，37℃、5%CO2中培养24 h后随机分为4组：两个实验组分别加入10 μL不同浓度的E-ADM-Ab-NPs和E-ADM，两个对照组则分别加入10 μL Ab-NPs和培养液。分别继续培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d后，每孔加入10 μL MTT液（5 mg/mL）培养4 h，吸弃上清液，每孔加入100 μL二甲基亚砜，振摇15 min后用酶标仪测定490 nm波长处的吸光度值（OD490），计算各孔的细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=（对照孔OD490-实验孔OD490）/对照孔OD490×100%。

1.5 半数抑制率浓度值（IC50）的计算

IC50是指使细胞生长抑制50%时药物的浓度，采用Bliss法[5]计算。

1.6 统计学处理

结果以均数±标准差（x±s）表示，所得数据采用SPSS 11.0 统计软件进行处理，组间细胞生长抑制率利用t检验进行比较。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E-ADM-Ab-NPs的粒径及抗体活性

扫描电镜观察可见E-ADM-Ab-NPs大部分呈规则的球形，表明较光滑，分散性良好。动态光散射粒径分析仪测得E-ADM-Ab-NPs的平均粒径为（190±21） nm。ELISA法检测表明，不同稀释倍数的E-ADM-Ab-NPs具有不同的抗体活性保存率，与同浓度游离抗VEGFR2单抗的活性相比，交联物的抗体活性保存率达85%以上。

2.2 E-ADM-Ab-NPs的体外释药曲线

在体外条件下，E-ADM-Ab-NPs的释药曲线主要分为突释和缓释两个阶段（图1）。在前24 h内存在药物突释现象，突释药量约占总药量的42.16%，随后药物呈持续缓慢释放，240 h后释放趋于平衡，累积释药量可达93.46%。

图1 E-ADM-Ab-NPs的体外释药曲线，分突释和缓释两个阶段

2.3 E-ADM-Ab-NPs及E-ADM的时间依赖性杀伤效应

依据不同时间点E-ADM-Ab-NPs和E-ADM对人肝癌Bel 7402细胞的IC50值，绘制时间依赖性杀伤效应曲线（图2）。结果表明，E-ADM-Ab-NPs的时间依赖性杀伤效应在1～10 d呈持续增强趋势，而E-ADM的时间依赖性杀伤效应主要体现在1～6 d，之后则处于一平台期。E-ADM-Ab-NPs在1～6 d各时间点的IC50值均稍高于E-ADM，而6 d后的IC50值则低于E-ADM。

E-ADM-Ab-NPs的杀伤效应在1～10 d持续增强，E-ADM的杀伤效应则主要体现在1～6 d

图2 E-ADM-Ab-NPs和E-ADM对人肝癌细胞的时间依赖性杀伤效应曲线图

2.4 E-ADM-Ab-NPs及E-ADM的剂量依赖性杀伤效应

不同浓度的E-ADM-Ab-NPs和E-ADM对人肝癌Bel 7402细胞的生长抑制率见表1。结果表明，两者对人肝癌Bel 7402细胞的体外杀伤效应均呈剂量依赖性，即药物浓度越高，对肝癌细胞的杀伤效应越强。体外试验中E-ADM-Ab-NPs和E-ADM的最大细胞生长抑制率分别为（97.1±3.8）%和（95.7±4.1）%，而两者在各浓度点的杀伤效应差异无统计学意义（P > 0.05）。

3 讨论

表阿霉素是常用的蒽环类抗肿瘤药物，可用于肝癌、胰腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤的辅助化疗，但该药具有的心脏毒性、骨髓抑制等毒副作用，在一定程度上限制了其在临床上的应用[6]。药物靶向治疗是一种新型的化疗方法，在提高化疗药物疗效、降低毒副作用方面具有广阔的前景，而载药纳米微粒及单克隆抗体则是近年来相关研究的热点。聚电解质复合法通过阴阳离子聚合物之间的静电作用制备纳米微粒，具有条件温和、简便快捷、粒径纳米级可控等优点，本研究在前期研究中选用可生物降解的海藻酸钠和阳离子瓜尔胶为载体材料，利用该法制备E-ADM-NPs。

本研究以EDC为交联剂，将抗VEGFR2单克隆抗体与海藻酸钠分子链上富含的羧基相交联，制得形态规则、分散良好的E-ADM-Ab-NPs。E-ADM-NPs中抗体活性保存率达85%以上，表明在交联物制备过程中抗VEGFR2单抗活性无明显丧失。E-ADM-NPs的体外释药初期存在突释现象，主要由吸附于纳米微粒表层的药物脱落造成，随后海藻酸钠和阳离子瓜尔胶构成的聚合物膜逐步溶蚀、降解[7]，E-ADM借助浓度梯度透膜向外扩散，形成E-ADM-NPs的缓释阶段。E-ADM-NPs在体外介质中可持续释放10 d，累积释药量达93.46%，表明其具有良好的缓释性能。

E-ADM-NPs和E-ADM对人肝癌Bel 7402细胞的体外杀伤效应均呈时间和剂量依赖性。E-ADM的时间依赖性杀伤效应主要在1～6 d，这期间E-ADM-NPs的累积释药量仅为63.32%，故其测得的IC50值稍高于E-ADM，6 d之后随着药物的不断释放，其IC50值逐渐低于E-ADM。研究结果表明，E-ADM-NPs作为一种药物缓释制剂，其时间依赖性杀伤效应在1～10 d呈持续性增强，可显著延长E-ADM的有效作用时间。E-ADM-NPs对人肝癌Bel 7402细胞的生长抑制率均高于同浓度的E-ADM，但两者之间的差异无统计学意义，表明交联物的制备过程并未影响E-ADM的细胞毒性。

VEGFR2主要分布于肿瘤组织，抗VEGFR2单抗能与VEGFR2上的抗原特异性结合，从而抑制肿瘤血管的生成，同时将化疗药物携带至肿瘤组织中，发挥免疫靶向治疗作用[8]。本研究制得的E-ADM-NPs具备良好的缓释性能，在不影响抗VEGFR2单抗活性和E-ADM细胞毒性的同时，能使肿瘤组织较长时间处于有效的药物浓度中，从而为E-ADM-NPs在动物模型体内的靶向抗肝癌作用研究提供了可靠的依据。

[参考文献]

[1] 忻志鸣，叶根深. 纳米粒制剂研究进展[J]. 中国药业， 2010， 19（16）： 15-17.

[2] 撒忠秋，秦建民，倪雷. 纳米粒在肝癌靶向治疗中的研究进展[J]. 肝胆外科杂志， 2010， 18（2）：145-147.

[3] 杨峰， 袁崇德， 庞泓， 等. 聚电解质复合法载表阿霉素纳米微粒的制备及抗胰腺癌作用的研究[J]. 当代医学，2009， 15（33）：1-2.

[4] Ramirez J，Duffort D， Obispo TM， et al. Group 5 determination in Pooideae grass pollen extracts by monoclonal antibody-based ELISA. Correlation with biologic activity[J]. Allergy， 1997， 52（8）：806-813.

[5] 孙忻， 樊宏伟， 王书奎， 等. 阿司匹林、氯吡格雷联用对人胃黏膜上皮细胞株GES-1增殖的影响[J]. 胃肠病学和肝病学杂志， 2010， 19（6）：520-523.

[6] 张颖， 嵇平. 组织速度成像对蒽环类药物心脏毒性的评价[J]. 中华全科医学， 2011， 9（1）：10-11.

[7] 吴秋惠， 吴皓， 王令充， 等. 海藻酸钠微球的制备及其在药物载体中的应用进展[J]. 中华中医药杂志， 2011， 26（8）：791-794.

[8] 李红， 李岳， 王兰， 等. 以血管内皮生长因子及其受体为药靶的抗肿瘤药物的研究进展[J]. 成都医学院学报， 2011， 6（3）：271-275.

（收稿日期：2013-04-10 本文编辑：林利利）