染色体异常与儿童急性淋巴细胞白血病关系的研究进展
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【中图分类号】R733.71【文献标识码】A【文章编号】1005-2720(2009)07-0283-04
急性白血病(acute leukemia，AL)在儿童恶性肿瘤性疾病中占首位，是我国儿童恶性肿瘤性疾病主要的死亡原因之一。急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)占小儿白血病的75%[1]。ALL是造血系统恶性增生性疾病，为造血干细胞在分化过程中的某一阶段发生分化阻滞、恶性增生所致，是克隆病、基因病。国外资料表明80%～90%以上的ALL具有克隆性染色体异常[2]，其与儿童白血病治疗的疗效、预后密切相关。现将儿童常见染色体核型异常及近期研究成果综述如下。
1 儿童ALL常见染色体异常
1.1 Ph染色体：由于第9号染色体长臂3区4带(9q34)断裂，其脱落的部分易位到22号染色体长臂1区1带(22q11)，由此形成的异常22号染色体即为费城染色体(philadelphia chromosome，Ph染色体)。这种易位使9号染色体长臂远端的ABL原癌基因易位至22号染色体的BCR基因断裂点，在分子水平上形成BCR-ABL融合基因。约5%的儿童ALL伴Ph染色体阳性，这是儿童ALL预后不良的独立因素之一[3]。
1.1.1 BCR-ABL融合基因与白血病发病机制：Bcr-Abl融合蛋白(BCR-ABL)包括多个功能域，具有复杂的生物学活性。目前有关BCR-ABL与白血病发病机制的研究，可归纳如下。
1.1.1.1 持续增强的酪氨酸激酶活性：蛋白质的磷酸化修饰是体内蛋白质类物质活性快速调节的重要方式之一。酪氨酸激酶是细胞内广泛存在的一种主要的蛋白激酶，能催化ATP分子的r-磷酸基团转移至蛋白分子中的酪氨酸残基，磷酸化的蛋白质分子通过一系列细胞信号转导，调节细胞增殖、分化和凋亡等。正常情况下，酪氨酸残基受到酪氨酸激酶和磷酸化酶的精密调控，磷酸化的酪氨酸残基只占1%以下。9号染色体上的c-ABL基因编码的蛋白质具有酪氨酸激酶的活性，表达水平随着髓系细胞的成熟而减少。BCR-ABL则具有持续增强的酪氨酸激酶活性，其主要涉及的靶蛋白为Crkl、Shc、Fes、Vav和Paxillin等，影响细胞增殖、分化和凋亡等的信号转导过程[4，5]。
1.1.1.2 抑制凋亡：BCR-ABL通过下列途径，削弱细胞对生长因子的依赖性：①激活细胞内的Stat系统，使Stat蛋白磷酸化并作为有活性的转录因子进入核内，影响相关基因的表达，进而改变靶细胞增殖与分化。②作用于白细胞介素-3受体、干细胞受体等生长因子受体，干扰生长因子对细胞的增殖调控，引起细胞的过度增殖。
上述各种机制相互交叉，共同影响细胞增殖、分化和凋亡，从而导致白血病的发生。
目前已可通过逆转录病毒转染、转基因、基因敲入等技术，将BCR-ABL融合基因导入鼠科动物体内，并合成P190和P210，建立白血病动物模型，进一步证实BCR-ABL基因的致白血病作用[4，6]。
1.1.2 Ph+-ALL儿童的临床特点：儿童ALL的Ph阳性率约为5%，较成人低。其BCR基因断裂点约90%位于m-BCR，仅10%位于M-BCR；而成人ALL的Ph阳性率为20%，其BCR基因断裂点约50%~80%为M-BCR，20%~50%为m-BCR；慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)CML的Ph阳性率约为90%~95%，其BCR基因断裂点99%以上为M-BCR，m-BCR则小于1%[4]。
Arico等[7]系统分析了326例Ph+-ALL儿童初诊时的临床特征，结果显示：年龄范围0.4~19.9岁，平均8.1岁，其中2岁以下者占11%，1岁以下者仅1人；男性占64%；外周血白细胞总数>50×109/L者约占一半，
1.1.3 Ph+-ALL儿童治疗、预后：BMT和化疗是目前治疗BCR-ABL阳性儿童ALL主要手段，5年EFS为27%~50%[9，10]。文献报道[11]，Ph+-ALL儿童行骨髓移植后3年、5年、10年无事件生存率(EFS)分别为56%、51%和46%，研究显示首次完全缓解(CR)后选择配型相合的有关供者(matched related donor，MRD)BMT疗效最好。Ph+-ALL儿童的预后除与治疗方案有关外，还与初诊时年龄、白细胞计数及泼尼松应有关[7]。
1.2 t(12；21)：以住发现儿童ALL最常见的染色体易位为t(9；22)、t(1；19)和t(4；11)，但总的发生率低于15%，t(12；21)常规核型分析(CCA)检出率不足0.05%。Romana等应用FISH的方法，发现t(12；21)为儿童ALL的一类隐匿性重现型易位。t(12；21)(P13；q22)易位使12号染色体上的TEL基因与21号染色体上的AML1基因交互易位，分别在12与21号染色体上形成TEL-AML1和TEL-AML融合基因[18]，伴有其他TEL基因的缺失。二者融合之后，AML1由转录活化因子转变为抑制因子。
1.2.1 t(12；21)的产生机制：发生t(12；21)时，TEL的断裂点位于内含子5，AML1断裂点80%~90%位于内含子1，其余发生在内含子2。两个基因的易位断裂点都集中于数个小区。不同患者中TEL和AML1的断裂区DNA序列并不一致，提示TEL和AML1的重组与DNA双链断裂后的损伤修复机制(即NHEJ)有关。
血清饥饿培养或VP16、水杨酸或氨茶碱等调亡刺激剂可诱导正常不成熟B细胞系发生TEL和AML1基因断裂，断裂点分别位于TEL的第内含子5和AML1的第内含子1；其中血清饥饿或氨茶碱还可诱导形成典型的TEL-AML1融合基因。提示t(12；21)的产生与凋亡刺激有关[12]。
1.2.2 TEL-AML1致白血病作用：t(12；21)ALL的白血病细胞能检测到TEL-AMLI mRNA和融合蛋白，仅1/3的患者同时有交互性的融合基因表达，说明此融合基因和白血病发病密切相关。TEL-AML1保留了TEL的HLH中间结构域，缺失ETS结构域，并拥有AML1的几乎所有功能结构域。TEL-AML1可通过Runt同源结构域与野生型AML1竞争DNA结合位点，显著负性地抑制野生型AML1的功能，使AML1调节的靶基因(M-CSF受体、IL-3和G-CSF受体基因等)的表达受抑制。专录抑制需要TEL-AML1中完整的HLH、Runt结构域及其后的74个aa结构。TEL-AML1可募集N-CoR、mSin3和SMRT核辅助抑制因子；这些核辅助抑制因子可能进一步与HDAC形成核辅助抑制复合物，抑制ANL1的靶基因转录。野生型AML1的功能缺失可能使细胞的游走性增加，对白血病的发生和发展起重要作用。此外，易位后的AML1基因的表达受TEL启动子操纵，融合蛋白本身也被泛素AUMO-1修饰并定位到TEL核体上，AML1易位后的异常表达与定位可能与白血病的发生有关。临床上t(12；21)患儿均为前体B系ALL，而TEL-AML1融合基因可诱导发生非前体B系ALL的发生，对此尚无明确解释。
虽然用普通的细胞遗传学方法TEL-AML1融合基因检出率
1.3 t(1；19)(q23；p13.3)：t(1；19)(q23；p13.3)易位形成E2A-PBX融合基因，产生的融合蛋白含有结合到PBX1同源结构域蛋白的DNA结合域上的E2A氨基端转录活化域，其潜在致瘤性依赖于Pbx蛋白C末端的Hox协同作用基序(HCM)。在前B细胞型ALL胞浆免疫球蛋白阳性中E2A-PBX1表达阳性的儿童ALL病例初诊时白细胞计数较高，使用强化疗方案后长期DFS现已接近80%。T(1；9)易位还见于1%的早期前B-ALL，但在这些病例中，E2A和PBX1基因功能均未受累，预后较好。
1.4 粒/淋混合系(MLL)基因重排：MLL基因位于11q23，其氨基端(含有AT钩和甲基化转移酶结构域)融合到许多蛋白质分子中，形成401种不同的融合蛋白，且已有至少33种伙伴基因被克隆。MLL基因重排最常见于t(4；11)(q21；23)和t(11；19)(q23；p13)，分别产生MLL/AF4和MLL/ENI融合基因。Hanson等[15]1999年证实MLL可维护激活的Hox基因转录，故推测基因重组所致MLL功能丧失是此类白血病发生的原因。一般认为，MLL基因融合与儿童ALL发生有直接关系[16]。见于70%婴儿和年长儿的ALL病例，通常具有前B细胞免疫表型、高白细胞计数、脏器肿大及中枢神经系统浸润，预后极差，尽管采取较强的化疗方案，长期无病生存率仍低于20%，故应及早进行骨髓移植[17]。
1.5 HRX(Homolog of Drosophila Frithorax)基因重排：Raimondi研究发现，染色体11q23上存在着一个与AL发生相关的重要基因，它和果蝇的Trithorax(三胸)基因有较高的同源性，故命名为HRX基因。分子生物学研究[17]提示11q23上几乎所有的断裂点都集中在HRX基因的一个狭窄区域内，和11q23发生易位的区域至少有10个，其中以4q21，9q22和19p23最为常见，分别形成t(4；11)(q21；q23)；t(9；11)(p22；q23)和t(11；19)(q23；p13)。2岁以内的婴儿急性白血病(infant acute leukemia，IAL)，IAL分子生物学的特点是有高比率的11q23异常，t(4；11)多见于婴儿ALL，1岁以内发生率50%，6个月以内发生率高达75%IAL患者，尤其是HRX基因重排的临床特点是：肿瘤负荷大，外周血白血病计数较高，肝脾肿大及中枢神经系统浸润明显，预后较差。
1.6 染色体数目异常：刘飞球[18]等研究认为：①染色体数大于50的超二倍体；占儿童ALL的25%～30%，常为L1、L2，起病年龄多为2～10岁，白细胞数和血清LDH较低，免疫学以早期前B-ALL多见，对治疗反应最好，对环磷酰胺、阿霉素和VP16敏感。②染色体数为47～50的超二倍体；占10%～15%，L1、L2居多，常为早前B型或前B型，预后中等，给予强烈化疗后预后可接近大于50的超二倍体组。③假二倍体：即伴有结构异常的46条染色体、以L2多见，大多数CD10阴性的早前B型和几乎所有的B细胞型。其WBC数和LDH较高，常规化疗差，特别是t(9；22)，t(4；11)或(8；14)，高度耐药。④亚二倍体，染色体数小于46，预后不良。⑤二倍体，见于B细胞型以外的其他类型，T细胞型高达30%，预后中等。
1.7 其他染色体结构异常：①t(8；14)(q24；q32)或t(2；8)(p12；q14)或t(8；22)(q24；q11)，这些易位和Burkitt淋巴瘤的特征性改变相同，见于75%～90%具有成熟B细胞表型的L3型ALL，预后恶劣。②t(4；11)(q21；q23)，该易位见于20%的儿童ALL，1岁以下和新生儿尤为多见，形态学上为L1、L2型，常表达髓系抗原CD15，WBC增高，预后差。
2 RNA干扰技术治疗儿童急性白血病常见染色体核型异常
2.1 研究现状：白血病是最早应用RNA干扰技术进行基因治疗研究的肿瘤性疾病之一，目前运用RNA干扰技术治疗儿童常见染色体核型异常AL的研究可分为二类：①抑制融合基因表达。染色体易位形成的融合基因是RNAi的主要靶标。Wilda等[19]对BCR-ABL融合基因的siRNA转染入K562细胞，经实时定量PCR和Western杂交证实，bcr/abl mRNA和融合蛋白p210的表达明显减少，并诱导了细胞凋亡；对没有该融合基因的细胞则没有杀伤作用；含有两个错配碱基的siRNA也不能抑制p210产生和诱导，表明RNA干扰具有高度特异性。Scherr等[20]对BCR-ABL融和基因阳性的ALL中BCR-ABL融合基因设计的针对断裂点丛事区siRNA成功地抑制了BCR-ABL融合基因mRNA80%以上的表达，并且证实这种特异性BCR-ABL融合基因siRNA能有效的抑制BCR-ABL融合基因细胞系的增殖。②抑制其他相关基因的表达。Cioca[21]针对人粒细胞白血病细胞系中的bel-2设计的siRNA有效抑制Bel-2mRNA的表达，从而抑制白血病细胞的增殖。
2.2 治疗机制：RNA干扰是(RNAi)在mRNA水平上由内源性工外源性RNA(dsRNA)诱发的高度特异的基因沉默机制，是理想的基因敲除新技术，能高效特异性的抑制癌基因表达。当dsDNA进入细胞后，在cer酶的作用下被裂解成干扰性小分子RNA(siRNA)，siRNA解链或与解螺旋酶核酶等蛋白形成RNA诱导沉默复合体，并且作为模板识别的目的mRNA，并对其进行逆进式剪切，形成强有效的瀑布效应，诱导序列特性的mRNA降解，从而使目的基因沉默[22]对儿童AL常见染色体核型异常运用RNA干扰技术进行治疗，可以彻底克服儿童急性白血病多药耐药，改善儿童急性白血病预后。
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[收稿 2009-02-02]