姜黄素CTPP—PEG—PCL胶束的制备及体外评价

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[摘要] 该研究合成了材料3-羧丙基-三苯基溴化鏻-聚乙二醇-聚己内酯（CTPP-PEG-PCL），并且采用自组装溶剂挥发法制备载姜黄素ctpp-peg-pcl胶束，芘荧光光谱法测定临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC），考察粒径、包封率、形态、体外释放度；采用MTT实验进行肝星状细胞毒性评价。所得材料CTPP-PEG-PCL经1H NMR表征确证其结构，CMC为2.252 mg·L-1，胶束粒径约为190 nm，含药量为（0.66±0.008） g·L-1，包封率（94±0.6）%，体外释放显示缓释特性，姜黄素胶束对肝星状细胞的生长抑制率显著高于姜黄素原料药（P

[关键词] 3-羧丙基-三苯基溴化鏻；聚乙二醇-聚己内酯；胶束；姜黄素；细胞毒性

姜黄素是从多年生草本植物姜黄的根茎中提取出来的一种多酚类化合物[1-2]。传统的姜黄素一般都是作为食品染料和添加剂，近年来，有大量的研究表明姜黄素有着广泛的药理作用，比如抗氧化作用，抗炎作用，抗癌作用，抗纤维化等[3-6]。但是姜黄素难溶于水，口服不易吸收，生物利用度低[7]。为了克服这些问题，设计一种有效的给药系统显得尤为重要。

聚乙二醇-聚己内酯（PEG-PCL）载药系统具有载药量高、载药范围广、体内滞留时间长、提高药物稳定性和生物利用度、降低毒副作用等特点，不仅可以实现被动靶向给药，还可在表面连接具有特异性识别功能的靶向分子实现主动靶向给药，使药物有效的到达靶点，目前已成为药物传递系统研究的热点之一[8-9]。

三苯基磷（TPP）及其衍生物是一类亲脂性阳离子化合物，它们不仅能穿透细胞膜（膜电位差Δψ=-30～60 mV），达到细胞浆内释放，而且可以继续利用细胞内线粒体膜电位差更大（Δψ=-150～180 mV）的特点，在线粒体内累积。现在TPP类化合物作为靶向配基已广泛用于细胞内靶向给药系统，TPPs可与药物化学键连接相接，比如，将抗氧剂辅酶Q与TPP通过化学键相连成MitoQ[10-11]，TPPs也能修饰在纳米载体的表面，例如硬脂酰基三苯基磷（STPP）修饰脂质体表面[12-13]。

本研究以3-羧丙基-三苯基溴化鏻 （CTPP）作为靶向基团修饰PEG-PCL，用自组装溶剂挥发法包裹难溶性药物姜黄素，制备CTPP-PEG-PCL载药胶束，进行体外评价。

1 材料

旋转蒸发仪（天津玻璃仪器厂制造）；SHZ-D（III）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；DZF-6020真空干燥箱（上海慧泰仪器制造有限公司）；Tensor 27红外光谱仪（美国Bruker公司）；WFZ UV-2000紫外-可见分光光度计（龙尼柯上海仪器有限公司）；Ζetasizer 3000HS 粒径仪 （英国 Malvern 公司）；Forma 3111水套式CO2培养箱（美国 Thermo Electron公司）；SW-CJ-2FD双人单面超净化工作台（苏州净化设备有限公司）；CKX41倒置相差显微镜 （日本 Olympus公司）；Model 680酶联免疫检测仪（美国 BIO-RAD公司）。

姜黄素（纯度98%，西安慈缘生化科技有限公司）；二甲氨基吡啶（DMAP，国药集团化学试剂有限公司）；N，N′-二环己基碳二亚胺（DCC，国药集团化学试剂有限公司）；CTPP（纯度>98%，Adamas Reagent Co.Ltd.）；PEG2000（Seebio Biotechnology，Inc.）；mPEG2000（Fluka 公司）；ε-己内酯（纯度99%，Nanqiao Town，Fengxian District，No. 1008 QIGANG Road in Shanghai）；柱色谱硅胶（200～300目，青岛海洋化工厂分厂）；薄层色谱硅胶GF254 （AR，青岛海洋化工有限公司）；噻唑蓝 （MTT，美国Amresco公司）；胰蛋白酶（Trypsin 1∶250，Gibco）；RPMI 1640（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；肝星状细胞HSC-T6（中国药科大学药理教研室）；其余化学试剂均为AR级。

2 方法

2.1 CTPP-PEG-OH的合成

准确称取CTPP 0.23 g，DCC 0.22 g，DMAP 0.025 g置250 mL圆底烧瓶中，氯仿20 mL溶解，室温搅拌2 h，分批加入PEG2000 0.5 g，氮气保护室温反应3 d，过滤除去不溶性副产物脲，旋转蒸发除去溶剂，冰乙醚沉淀，异丙醇重结晶。硅胶柱色谱分离产物，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇-氨水 200∶10∶8，TLC法鉴别（展开剂为二氯甲烷-甲醇-氨水 0.8∶0.16∶0.1），收集产物，旋转蒸发除去溶剂，真空干燥48 h，红外鉴定。

2.2 CTPP-PEG-PCL的合成

准确称取CTPP-PEG-OH 0.2 g，己内酯0.8 mL，置250 mL圆底烧瓶中，加入盐酸0.02 mL和乙醚0.3 mL作为催化剂，室温下反应24 h，冰乙醚沉淀结束反应[14]，硅胶柱色谱梯度洗脱（二氯甲烷-甲醇-氨水，按400∶20∶4～380∶20∶2进行梯度洗脱）分离产物，TLC法鉴别（展开剂二氯甲烷-甲醇-氨水 2∶0.2∶0.1），合并洗脱液，旋转蒸发除去溶剂，产物真空干燥48 h，核磁鉴定。

2.3 胶束的制备

采用自组装溶剂挥发法制备载药胶束，准确称取姜黄素5 mg，材料50 mg，丙酮1.5 mL溶解，缓慢滴加到蒸馏水6 mL中，室温磁力搅拌3 h，真空干燥30 min，0.45 μm滤膜过滤，得到姜黄素胶束溶液。

2.4 胶束体外性质考察

2.4.1 临界胶束浓度的测定 采用芘荧光探针技术测定CTPP-PEG-PCL空白胶束溶液的临界胶束浓度。取适量空白胶束溶液置于一系列10 mL量瓶中，定容后胶束溶液的质量浓度为1×10-5，1×10-4，0.0 004，0.001，0.004，0.01，0.04，0.1，0.4，0.8 g·L-1，加入芘使其终浓度为1 mg·L-1，超声30 min，40 ℃水浴孵育1 h，静置过夜，使芘和胶束之间充分平衡，测定芘胶束的荧光光谱强度。

2.4.2 粒径的测定 采用动态光散射法测定粒径和多分散性。

2.4.3 药物含量测定 采用紫外分光光度法测定姜黄素的含量，检测波长424 nm，姜黄素在甲醇溶液中的标准曲线为A=135 783C+0.005 4，r=0.999 8，在2～8 mg·L-1线性关系良好。

2.4.4 包封率的测定 取胶束溶液少量，用适量甲醇破乳后，测得胶束溶液中姜黄素总药量（胶束中包封药量和游离的药量总和）。另取适量胶束溶液，用截留相对分子质量为1万的超滤离心管离心10 min，测定滤液中药量（即游离药量）。包封率（%）=胶束中包封的药物量/胶束溶液中总药物量。

2.4.5 胶束粒子形态测定 移取稀释1 000倍的胶束溶液1 μL，置于盖玻片上，自然晾干，原子力显微镜观察胶束粒子的表面形态。

2.4.6 体外释药考察 分别取CTPP-PEG-PCL胶束溶液、mPEG-PCL胶束溶液和姜黄素的乙醇溶液1 mL置于透析袋（截留分子量为3 500），两端扎紧后置于500 mL，室温下恒速搅拌，平行操作3份。设定时间，每次取出全部释放介质测定，重新加入等体积的新的释放介质。紫外分光光度法测定释放介质中的药物含量， 计算累积释放度，绘制释药曲线。姜黄素在含30%乙醇的生理盐水中标准曲线A=0.272 2C+0.003 7（r=0.999 9），在0.03～0.36 mg·L-1线性关系良好。

2.4.7 MTT细胞增殖抑制试验 采用含青霉素 （10 U·mL-1）、链霉素（10 U·mL-1）和10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37 ℃，5%的CO2培养箱中培养肝星状细胞（HSC-T6）。每孔2万～3万个细胞接种于96孔细胞培养板中培养24 h，细胞贴壁，分别加入姜黄素的DMSO溶液、mPEG-PCL胶束溶液、CTPP-PEG-PCL胶束溶液使姜黄素的终浓度为0，5，10，15，20，40 μmol·L-1，CO2培养箱中培养24 h后，加入噻唑蓝染液（5 g·L-1），每孔20 μL，继续培养4 h，吸出全部培养液，在96孔板中加入DMSO溶液，每孔150 μL，10 min内用酶标仪测定其在490 nm处的吸光度，计算细胞生长抑制率。

3 结果

3.1 CTPP-PEG-PCL的合成

CTPP-PEG-PCL的合成路线见图1。

CTPP-PEG-OH红外图谱显示，在1 280.00 cm-1处，有VC-O-C，归属于-OC-O-C-，在1 730.00处有VC=O，归属于-OC-O-，在3 417.72 cm-1处，有VOH，归属于-CH2-OH-，以及苯环上的特征峰VФ-H，VФ-H，VC=C，γC-C，在3 000，1 600，1 500，740.84，842.28，691.78 cm-1处均有出现，1 716.2 cm-1处，-COOH的VCO峰因为形成酯键而消失，说明CTPP的羧基已经成功连接到HO-PEG-OH上，合成产物CTPP-PEG-OH。经1H NMR（CDCl3， 500 MHz）检测，7.77 ppm（s，1H，ArH），7.85 ppm（s，1H，ArH），3.6-3.7 ppm（m，-O-CH2CH2-），3.93 ppm（t，2H，-CH2-）。

3.2 胶束的制备和体外性质考察

3.2.1 临界胶束浓度的考察 固定发射波长390 nm，狭缝宽度EX 3，EM 1.5，对一系列浓度的胶束溶液扫描测定激发光谱，根据芘在335，338 nm的荧光强度比值对-lgC作图，曲线拐点处对应的材料浓度即为临界胶束浓度，为0.002 252 g·mL-1，见图2。该材料的临界胶束浓度很小，表明该胶束具有很好的热力学稳定性，即使被稀释到很低浓度依然能够维持其胶束结构。

3.2.2 胶束性质的考察 自组装溶剂挥发法制备的胶束平均粒径为193 nm，多分散性系数为0.229，含药量为（0.66±0.008） g·L-1，包封率为（94±0.6）%。

3.2.3 原子力显微镜考察粒子表面形态 姜黄素胶束的原子力显微镜图像见图3，胶束形态圆整，粒径分布均匀，粒径大约为80 nm。样品在载玻片制片过程中，水分挥发可能导致胶束萎缩，使得粒径变小。

3.2.4 体外释药考察 分别在4，8，12，36，60，108 h测定胶束的累积释药量，释放曲线见图4。CTPP-PEG-PCL和mPEG-PCL胶束溶液均具有明显的缓释特征，CTPP的连接对药物的释放特征没有显著影响。可能是因为姜黄素为强亲脂性药物，被紧密包裹在PCL内核中，胶束的核壳结构阻碍了内核与释放介质的接触，PCL降解缓慢，延长了药物的释放时间。

用DDsolver对CTPP-PEG-PCL的释放特性进行模型拟合，分别以一级动力学方程、Higuchi方程、Hixson-Crowell方程、Weibull方程、Peppas-Sahlin方程对CTPP-PEG-PCL胶束体外释药数据进行拟合， 求出曲线拟合方程和相关系数（R2）。累积释药分数的拟合方程见表1，R2越接近1， 表明拟合效果越好，结果表明胶束的体外释药符合Peppas-Sahlin方程。

3.3 MTT法细胞抑制率

细胞给药时，分为RPMI 1640培养基组、细胞+RPMI 1640培养基组、细胞+RPMI 1640培养基+药物组，细胞生长抑制率（%）=[（A细胞+1640培养基-A1640培养基组）-（A细胞+1640培养基+药物组-A1640培养基组）]/（A细胞+1640培养基-A1640培养基组），结果见图5。姜黄素原料药和CTPP-PEG-PCL胶束对肝星状细胞均具有抑制效果，且随着给药浓度的增加，抑制率增加，相同浓度下胶束的抑制率高于原料药，经t检验，姜黄素溶液和CTPP-PEG-PCL胶束的细胞生长抑制率在各浓度下均存在显著性差异（P

4 讨论

本研究成功合成了一种新的具有细胞靶向性的材料CTPP-PEG-PCL，采用盐酸和乙醚代替常用的辛酸亚锡来催化己内酯聚合，降低了反应成本，后处理简单，避免引入更多的杂质。通过红外图谱和核磁共振图谱进行结构表征，证明了材料结构。

嵌段共聚物胶束的制备主要有自组装溶剂挥发法、薄膜分散法、透析法等。本试验采用自组装溶剂挥发法，该法操作简单，制备的胶束有较高的包封率，有利于进一步制备注射剂或者冻干制剂。芘荧光光谱法测得CTPP-PEG-CL临界胶束浓度低，在体内具有更高的稀释稳定性。采用超滤离心法测定包封率，时间短，无需特殊仪器，准确率高，重现性好。

为了满足体外释放的漏槽条件，考察了表面活性剂以及有机溶剂对姜黄素的增溶效果，发现表面活性剂的增溶效果不佳，经测定姜黄素在30%乙醇的生理盐水溶液中饱和溶解度为4.6 mg·L-1，作为释放介质能够达到漏槽条件。体外释放度试验表明，姜黄素溶液在24 h内全部释放，而姜黄素胶束在108 h内累积释药不超过40%，具有明显的缓释效果，说明姜黄素与CTPP-PEG-PCL之间具有较强的相互作用，有望提高体内循环时间。

CTPP-PEG-PCL胶束显著提高了姜黄素对肝星状细胞的抑制作用，可能引起细胞内姜黄素浓度升高，增强了姜黄素的跨膜转运和细胞内蓄积能力。Marrache等分别制备载氯尼达明、姜黄素、2，4-二硝基酚的TPP-PEG-PLGA纳米粒，对癌症、阿尔茨海默病、肥胖的治疗指数均高于非靶向纳米粒或者游离药物[15]。有研究表明细胞内线粒体是药物诱导肝星状细胞凋亡的靶点[17]，只有提高细胞内的药物浓度才能增强其药理活性。CTPP-PEG-PCL如何促进姜黄素跨膜转运并进一步到达细胞内作用靶点需要进一步研究。

[参考文献]

[1] Aggarwal B B， Kumar A， Bharti A C. Anticancer potential of curcumin preclinical and clinical studies[J]. Anticancer Res， 2003（33）：363.

[2] Maheshwari R K， Singh A K， Gaddipati J， et al. Multiple biological activities of curcumin：a short review[J]. Life Sci， 2006， 78（18）：2081.

[3] Huang M T. Phenolic compound in food and their effect on health Ⅱ[M]. Washington DC：American Chemical Society， 1992：34.

[4] Saja K， Mani S B， Karunagaran D. Anti-inflammatory effect of curcumin involves down regulation of MMP-9 in blood mononuclear cells[J]. Int Immunopharmacol， 2007， 7（13）：1659.

[5] Yallapu M M， Jaggi M， Chauhan S C， et al. Curcumin nanoformulations：a future nanomedicine for cancer [J]. Drug Discov Today， 2012， 17（1/2）：71.

[6] Wang M E， Chen Y C， Chen S， et al. Curcumin protects against thioacetamide-induced hepatic fibrosis by attenuating the inflammatory response and inducing apoptosis of damaged hepatocytes[J]. J Nutr Biochem，2012， 23（10）：1352.

[7] Ravind R V， Chandrasek H N. Absorption and tissue distribution of curcum in rats[J]. Toxicology， 1980， 16（3）：259.

[8] Salmaso S， Bersani S， Semenzato A， et al. New cyclodextrin bioconjugates for active tumour targeting[J]. J Drug Target， 2007， 15（6）：379.

[9] Marczylo T H， Verschoyle R D， Cooke D N， et al. Comparison of systemic availability of curcumin with that of curcumin formulated with phosphatidylcholine[J]. Cancer Chemother Pharmacol， 2007， 60（2）：171.

[10] Murphy M P， Smith R A J. Targeting antioxidants to mitochondria by conjugation to lipophilic cations[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol， 2007（47）：629.

[11] Kelso G F， Porteous C M， Coulter C V， et al. Selective targeting of a redox-active ubiquinone to mitochondria within cells：antioxidant and antiapoptotic properties[J]. J Biol Chem， 2001， 276（2/3）：4588.

[12] Boddapati S V， Tongcharoensirikul P， Hanson R N， et al. Mitochondrio-tropic liposomes[J]. J Liposome Res， 2005， 15 （1/2）：49.

[13] Patel N R， Hatziantoniou S，Georgopoulos A， et al. Mitochondria targeted liposomes improve the apoptotic and cytotoxic action of sclareol[J]. Liposome Res， 2010， 20（3）：244.

[14] Zeng F， Allen C. Synthesis of carboxy-functionalized heterobifunctional poly（ethylene glycol） by a thiol-anionic polymerization method[J]. Macromolecules， 2006， 39（19）：6391.

[15] Marrache S， Dhar S. Engineering of blended nanoparticle platform for delivery of mitochondria-acting therapeutics[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2012， 109（40）：16288.

[16] Lian L H， Park E J， Piao H S， et al. Aloe emodin-induced apoptosis in t-HSC/Cl-6 cells involves a mitochondria-mediated pathway[J]. Basic Clin Pharmacol， 2005， 96（6）：495.

Preparation and in vitro evaluation of curcumin CTPP-PEG-PCL micelles

ZHANG Li-qiao， LUAN Li-biao*， WU Yan， WANG Dong-mei

（Department of Pharmaceutics of China Pharmaceutical University， Nanjing 211198， China）

[Abstract] To synthetize 3-carboxypropyl-triphenylphosponium bromide-polycaprolacton-CTPP-PEG-PC， and prepare curcumin CTPP-PEG-PCL micelles by using the self-assembled emulsion solvent evaporation method， in order to determine the critical micelle concentration （CMC） with the pyrene fluorescent probe technology， detect the particle size， entrapment efficiency（%）， morpheme and in vitro release rate， and evaluate the cytotoxicity of hepatic stellate cells with MTT assay. The structure of CTPP-PEG-PCL had been identified by 1H-NMR spectra. Specifically， the CMC of polymer was 2.25 mg·L-1， the average size was 190 nm， the drug content was （0.66±0.008） g·L-1， and the entrapment efficiency was （94±0.6）%. The in vitro release results showed curcumin micelles had a significant higher inhibition ratio in the growth of hepatic stellate cells than crude curcumin （P

[Key words] CTPP； PEG-PCL； micelle； curcumin； cytotoxicity

doi：10.4268/cjcmm20131315