皮肤生物学的现代技术概述
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■文/北京大学医学部北京耐确生化技术研究所刘毅
最近，受其他许多领域先进技术一定程度上的推动，对皮肤生物学的分子与生物化学调控的认识越来越深。首先，虽然还不大可能在体外定义的游离血清媒介中将大鼠和人类表皮角化细胞多次扩增，但是，现在已有可靠方法分离和培养大鼠和人类表皮功能的角化细胞。此外，现在还能在体外诱导鳞片状变异，因此，表皮细胞增殖和终端变异的调控，能在限定的情况下进行研究。一些具体的培养模式，已经发展到能在正常分层表皮细胞中表达。
皮肤生物学中具体蛋白和基因的功能研究有三条主要途径。第一,在体外模型中，可以使用特定酶的化学抑制剂或激活剂的药理学方法，阻碍或者诱导活性，以及确定其功能。其次，应用重组的逆转录酶病毒，可以感染细胞，但不会复制新的病毒，特定基因能够借此转移给初始角化细胞，并对细胞施加特定功能。更重要的是，这些已改变的初始细胞，还可以通过给裸鼠移植皮肤的方法，复原为体内环境的细胞。在这个方法中，胰蛋白酶作用培养的初始大鼠，和人角化细胞与初始皮肤纤维原细胞混合。沉降的细胞浆移植到预备已被切除一圈的主体表皮和真皮的裸鼠的背部；经过1-2周，新的表皮就由移植的细胞重新建立起来。就产生了新生表皮细胞的结构和生物化学性质。
二、皮肤的结构和功能
人体最大的器官――皮肤是人体与外界环境之间的一道天然防御性屏障，它阻止微生物的侵入、放射线的吸收和水分的丢失。皮肤包括覆盖的上皮层――表皮（epidermis）和下面的结缔组织矩阵――真皮（dermis），以及脂肪组织（hypodermis），每一层都包含有不同的细胞类型和结构，这对于皮肤的特定功能很重要。
表皮 表皮的主要成分是连续的再生上皮细胞或者角化细胞。这一角化层具备的功能是产生角化细胞鳞片状异化的终端产物。特殊的表皮附加物――毛发和脂腺及汗腺――也是由表皮层演化而来。 除了角化细胞，表皮还包含许多迁移细胞。黑素细胞是一种色素分泌细胞，它保护皮肤抵制紫外线的照射。Merkel细胞可能具有感觉神经的功能。最后，Langerhans细胞，为一种免疫系统的细胞，有防护环境中抗原的功能。
真皮组织矩阵 真皮的结缔组织矩阵对上面的表皮层（也包括神经网和血管网）提供了结构上的支撑。这一矩阵由间质演化细胞或者纤维原细胞（分泌纤维状和细丝状蛋白网以拼凑细胞外的矩阵）组成。免疫系统的细胞，比如巨噬细胞和肥大细胞，是真皮的常驻成分；对于特定刺激的应答淋巴细胞也会渗透到该真皮层。真皮还能保护机体避免机械伤害，充当水分储存库，在体温调节和感官接受方面也发挥着重要作用。此外，真皮对于上层表皮的再生和修补也很重要。
基底膜 在表皮和真皮之间是一层特殊蛋白结构的基底膜，这层膜由大量普遍存在的矩阵分子组成，比如四型胶原质和磷脂硫酸蛋白多糖，以及分层鳞片状上皮细胞的特殊蛋白质。表皮通过整合素锚定在基底膜上，横跨膜的蛋白则联结细胞外矩阵和细胞内的角蛋白细丝网结构，比如移植、创伤愈合以及终端异构化等，一定程度上受该类附加结构的调控。由四型胶原质组成的支柱原纤维连接着真皮和表皮，并支撑着组织。另外，表皮和真皮细胞之间的相互作用可能也是通过基底膜来调节。
基细胞层 表皮细胞的增殖被限制在基细胞层，它与基底膜接触。基细胞向上基细胞层的扩增与增殖空间的缺失有关。高度特异性并发攻击和基因程序性表达最终导致无生命力的鳞片状产物或者角质化细胞的产生。
例如，基层细胞表达为一类特殊的丝状结构蛋白――角蛋白K5和K14。在最先的棘粒层，不同对的角蛋白K1和K10被诱导。
在上部细胞层，交联包膜的成分――loricrin和involucrin被表达；还有filaggrin,一种与中介细丝联系在一起的蛋白；或者表皮转糖苷酶，在移植细胞初期交联蛋白形成角质化包膜细胞的过程中发挥重要作用。这样，人的角化细胞在大鼠背部重建人类表皮细胞，而且这一类的大鼠细胞依然保留着移植前的特定基因性质。
这一技术的两个主要用途是，研究皮肤癌发病机理定致癌基因的作用，以及研究毛发生长所需要的细胞成分。例如，从新生大鼠表皮细胞中分离出的毛囊萌芽与真皮乳突细胞混合，移植地方的毛发出现丰富生长。相比之下，毛囊萌芽同真皮纤维原细胞或者纤维原细胞系共同培养，则毛发生长很少。这样看来，毛发的生长需要两种细胞类型的相互作用，我们也正使用这个体系来定义包含在这个过程中的分子信号。
转基因小鼠 最近更多的分子基因学的先进技术已被用于体内皮肤生物学调控的研究，这包括旨在通过使用转基因小鼠充分表达有关表皮的具体基因，以及通过删除这些基因制造“丧失性小鼠”模型。
简而言之，就是制造靶向基因小鼠，即将一个可以调控表皮增殖或者分化的克隆基因，置于表达调控的控制之下。把这个重组细胞质粒体外微剂量，注射到受精小鼠卵细胞中，再将这个卵细胞移入一个假孕的母鼠体内。如果这个DNA质粒介入卵细胞的DNA链，并通过幼殖体遗传，一类新的小鼠族就诞生了，它仅在我们关心的皮肤基因表达上，有别于其他普通小鼠。
剥脱性技术包括 删除体外培养的全能未分化胚胎干细胞上的一段DNA链上让我们感兴趣的基因。这段我们感兴趣基因的特定区域，被同源同顺序重新联合的断链细菌DNA替换。由于它们的全能性可以参加与胚胎细胞一起的正常减数分裂，这将导致具有一个正常和一个变异非功能基因细胞的产生。这些已被特定删除基因的细胞，被注入一个早期小鼠胚胎（胚泡）内。如果介入幼殖体，特定基因删除的同源小鼠品种也能创造出来。
三、皮肤构造的调控
最近因为编码人类相关蛋白基因的突变而导致许多遗传性皮肤病被发现，这使我们明显看到了皮肤完整性和功能性结构蛋白的重要性。例如，皮肤酷热病，单一大泡的表皮松解（EBS）和角化过度的表皮松解是由于相关的角蛋白14和1的特异性突变引起的。这些疾病的病理特征是变异角蛋白表达的细胞层松散，由于受下层细胞分离的影响而出现水泡状。其他结构性蛋白如Ⅳ型胶原质和α-6整合素的突变，也与各种酷热病相联系。
转基因小鼠技术已经用来解释基因突变和疾病病理学之间的特定因果关系。这样，表达人类角蛋白14突变基因的转基因小鼠，可以发展成为类似于EBS的一种酷热性疾病。这就突出了转基因小鼠技术在制造人类疾病的小鼠模型方面的实用性，也可以用来解释表皮分化中具体蛋白的相关性。
表皮分化的调控
细胞外钙离子的集中是体外表皮鳞片状分化的主要调控之一。在0.05毫摩尔钙离子中培养，小鼠初级角化细胞，有一个基细胞形态学且增生扩散呈显性。如果钙离子集中提高到0.12毫摩尔，细胞迅速停止增生扩散。它们此时往往成层并表现为刺状分化的特征，例如角蛋白1和10以及稍后时间点的角化包膜蛋白成分。
从远离表皮基层钙离子的梯度增加表明，细胞外钙离子的集中对于体内的分化也很重要。增加细胞外钙的主要作用，是通过打开细胞库，来提高细胞内的钙离子水平。阻滞细胞内钙释放的试剂，例如钙螯合剂和钙依赖性ATP酶抑制剂；再例如thapsigargin和cyclopiazonic酸钾，也阻碍终端分化，并维持细胞的基细胞表现型。
钙离子信号的主要激活剂之一，是细胞内的蛋白激酶C(PKC)。蛋白激酶C实际上是磷脂依赖性蛋白激酶家族中的一员，他们中的一些也依赖钙离子发挥最大活性。在体外，这些酶的药理学催化剂（例如佛波醇酯）诱导初级角蛋白的末期分化，同时抑制剂能阻滞钙离子介导的终端分化。
因为蛋白激酶C的活性在体外依赖油脂，内源性脂类可以充当酶活性的体内调节剂，而不是研究中激活这些酶类最常用的药理学试剂。胆固醇硫酸酯是一种内源性脂类化合物，可能在蛋白激酶C终端分化中是很重要的。在体外角质细胞分化期间，就会产生胆固醇硫酸酯，主要在表皮粒细胞层被发现。它能在体外激活一些PEC酶，并诱导标记终端的分化。有趣的是，人类X-相关的鱼鳞癣（一种角化细胞剥落失调）与角质层（SG）高水平的胆固醇硫酸酯有关。这样，总的来说，脂类生物合成调控剂中，脂类的应用可能在表皮构造上有着深远的意义。
另一类调控表皮分化的重要分子家族，是以维生素A为基础。这类维生素A的化合物，通过结合特定配基转录因素的核受体（RARs, RXRs）来激活或者抑制基因的转录。这些受体在结构上与类固醇激素的核受体有关。在体外维生素A酸，能抑制角化细胞的终端分化，而在体内，局部使用维生素A类物质，会诱导增生并改变角蛋白合成的类型。
另外，局部外用维生素A酸，会加速修复紫外线造成的小鼠和人类皮肤的损伤。这可能部分是造成细胞外表皮和真皮矩阵蛋白点的选择性表达。
两种转基因小鼠模型最近已经揭示了表皮功能中维生素A类化合物发挥的重要作用。RARs中一种非正常形式（实际上阻碍RAR功能）在分化的基细胞上层，或者表皮基细胞层。抑制上基层的RAR活性不能鳞片状分化，却会导致一种变态的表皮产生，它将会由于异常的脂质代谢而丧失屏障功能。相比之下，抑制基细胞层的RAR功能完全废止了鳞片状分化。
四、表皮增殖的调控
表皮细胞的增殖分化部分受多肽类生长因子的调控，它们中的一些在表皮产生，还有一些在真皮产生。生长因子是由结合特异细胞表面蛋白或受体的细胞分泌的一类小蛋白分子组成。受体产生一种生长因子即特定的细胞内信号。细胞内生长因子的行为很复杂，每一个都调节着许多细胞生长进程，比如增殖分化和细胞外矩阵的形成等等。
生长刺激因子 表皮生长因子（EGF）家族的成员是表皮程序性增殖扩增的主要积极调节因素。这个家族包括EGF、转换生长因子-ａ（TGF-ａ）、amphiregulin、肝磷脂结合表皮生长因子（HB-EGF）和 β-cellulin。虽然表皮生长因子在表皮中不表达，其他族成员也已经被检测到。
这些结构上与多肽类相关的因子都与同一表面受体――生长因子受体（EGFR）结合。将纯化的表皮生长因子注入小鼠表皮内会引起大量活细胞层的增长和增厚，如果总的使用纯化的表皮生长因子或者转换生长因子-α,人工诱导的伤口会加速愈合，这就暗示着这些生长因子的内源性表达包含在这个复杂的过程之中。
近来，转基因和分离小鼠的技术已经提供了许多表皮中有关表皮生长因子配体家族的有用线索。旨在充分表达表皮基部间隔中的转换生长因子-α引起过度的增殖扩增。然而，基因被删除的小鼠，在构造或者伤口愈合上，表皮的应答没有显示作用，但是毛发的构造和表皮毛囊的排列有了深刻的变化。
剥脱转换生长因子-ａ的动物毛发和胡须有明显的卷曲。尽管结构上正常，毛囊在表皮中的排列没有规则，而且不适当地朝真皮向下生长。因为转换生长因子-α在正常的毛囊中表达，使毛发的形成和毛囊的定位以及朝真皮向下生长都很重要。
KGF的调控 角化细胞生长因子（KGF）又是一种表皮细胞的促细胞分裂剂。它由不自我表达的表面角化细胞生长因子受体――真皮纤维原细胞分泌。角化细胞生长因子在真皮下列伤害时的表达增加，局部角化细胞表皮生长因子，将增加伤口愈合的速度。这可能是受到角化细胞增殖扩增，及角化细胞生长因子移植的刺激的影响。有趣的是，角化细胞生长因子能够诱导角化细胞培养的转换生长因子-α的表达，并暗示他的增殖扩增有可能是间接的。转基因小鼠表达的一种角化细胞生长因子受体的优势消极突变，旨在使有外皮萎缩的表皮基细胞层减少表皮细胞的增殖扩增，并减少毛囊的数量。令人吃惊的是，这些动物的真皮也有过多的结缔体素沉积物，显示表皮角化细胞生长因子发起的负反馈路线控制着真皮纤维原细胞矩阵的生成。由于伤口的不完全表皮化，这些动物的伤口愈合也被削弱。
生长抑制剂 与多肽类紧密相关的化合物，像我们知道的转换生长因子-β(TGF-βs)，是影响皮肤生物学性质中最重要的生长因子。转换生长因子-β有三种成员――TGF-β1、β2和β3，每一种都是重要的基因产物。所有培养的表皮细胞，包括小鼠和人类的角化细胞，对细胞增殖受抑制的外源性转换因子-β都会做出应答反应。转换生长因子-β能够抑制积极生长因子，例如EGF/TGF-α的刺激性作用，但是当转换生长因子-β移走后，这种作用将会翻转。转换生长因子-β不会直接诱导角化细胞的终端分化，然而协同特定的鳞片状分化诱导剂作用的结果显示转换因子-β可能在这个过程中有作用。其他还有报道转换因子-β作用于角化细胞，包括细胞与细胞间以及细胞与矩阵间的粘连蛋白的诱导。
在培养增长基细胞表现型的条件下,小鼠角化细胞表达低水平的转换因子-β1 mRNA 和蛋白。这种体内表达的反映在小鼠和人类表皮的基细胞层的转换生长因子-β1蛋白和mRNA都呈现。可能在这些细胞中，转换因子-β1充当了一个细胞增殖的自我负反馈调节剂，因为在转换生长因子-β1被实验性删除的小鼠表皮和培养的角化细胞中，细胞增殖则被加快。这方面的其他迹象来自表皮中转换因子-β1特异性过分表达的转基因小鼠。这些动物在出生后不久即死亡，因为表皮的细胞增殖被完全抑制，皮肤不能随着幼体的生长而扩增。
对培养的角化细胞末期分化的诱导导致了转换生长因子-β1表达和分泌的减少，转换生长因子-β2 mRNA表达和缩氨酸分泌的增加。在小鼠和人类表皮中，转换因子-β2特异性定位于上基层正在分化的细胞层。这说明转换生长因子-β在上基层细胞的表达包括鳞片状分化，可能转换生长因子-β1或者转换生长因子-β2表达的特异性调节能够改变表皮的细胞增殖或者鳞片状分化。
大量的研究也已经将转换生长因子-β1、转换生长因子-β2和转换生长因子-β3锁定在小鼠和人类真皮纤维原细胞。与其对表皮细胞的作用相比较，这些生长因子对纤维原细胞的作用，算是一种弱的促细胞分裂剂。更重要的是，转换生长因子-β族是间质细胞，产生细胞外基底的潜在刺激剂。转换生长因子-β还显示的作用有，增加基质蛋白的合成和分泌，减少基质蛋白水解酶的合成，增加细胞表面基质分子粘连蛋白的表达等等。所有这些影响，都说明转换生长因子-β，可能在组织重塑和伤口愈合方面发挥着重要的作用。
转换生长因子-β能够充当自身本来明显就是生长因子制造者的炎症细胞的化学诱导剂。此外，转换因子-β促进新血管的生成，通过角化细胞增加伤口纤维原细胞的增殖和移植。在一个人类皮肤伤口愈合的模型中，在伤口表皮以及随后的血管，炎症细胞和真皮纤维原细胞中被迅速诱导。转换因子-β1在伤口边缘移植的角化细胞中高水平表达，这与其充当角化细胞移植的促进剂相一致。有趣的是，类维生素A类化合物能够诱导非培养的角化细胞和表皮的转换生长因子-β1和转换生长因子-β2 ，这说明了这两类皮肤调控分子的重要联结机制。
总之，近来细胞培养和分子生物学方面的突破，已经帮助鉴别了表皮重要的结构成分和许多调节表皮细胞生长和分化的分子。现在许多实验室刚刚起步的分子基因学研究，将详细说明这些基因和蛋白对体内正常和病理状态的表皮所发挥的作用。