早期糖尿病大鼠肾组织尾加压素Ⅱ表达的实验研究

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[摘要] 目的:探讨早期糖尿病大鼠肾组织中尾加压素Ⅱ(urotensin Ⅱ,UⅡ)的表达及其意义。方法:用链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠模型,将实验动物分为正常对照组(C组)、糖尿病组(D组)和胰岛素干预组(Y组)。5周后收集肾组织,观察各组肾脏病理情况及UⅡ在肾组织中的表达。结果:处理5周后,与C、Y组比较,D组肾小球肥大、肾小球表面积显著增大,小管扩张,上皮细胞肿胀;D组肾小管上皮细胞UⅡ表达明显升高(与C组比较,P

[关键词] 尾加压素Ⅱ;糖尿病肾病;免疫组织化学;大鼠

[中图分类号] R-332 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721(2010)03(c)-019-03

Experimental study on expression of urotensin Ⅱ in renal tissue in STZ-induced early rats with diabetes

LIU Changbo,HUANG Huaying,CHEN Hanwei,FENG Zhengping,ZHENG Linhong

(Zengcheng People′s Hospital,Zengcheng 511300, China)

[Abstract] Objective: To explore expression of urotensin Ⅱ in renal tissue in STZ-rats with diabetes and its significance.Methods: Diabetic rats were induced by streptozocin(STZ), the experimental rats were randomly divided into three groups:normal control group(group C), diabetic rats(group D) and diabetic rats treated by insulin(group Y). 5 weeks later, the kidney specimens in different group were randomly collected and fixed in formalin and embedded with paraffin. The expression level and distribution of urotensin Ⅱ were evaluated withimmunohistochemistry technique. Results: After treatment of 5 weeks, urotensin Ⅱ levels in renal tubule epithelial cells in group D increased remarkably compared with those in group C(P

[Key words] Urotensin Ⅱ; Diabetic nephropathy; Immunohistochemistry; Rats

研究证实人类尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ,UⅡ)在糖尿病肾病患者肾小管内皮细胞及间质中出现大量异常表达,它在糖尿病肾病的发生发展中起了何种作用,目前尚不明确。为此,笔者采用STZ诱导的早期糖尿病大鼠模型观察糖尿病肾组织中UⅡ的表达及其意义。

1 材料与方法

1.1 动物模型及分组

健康、雄性SD大鼠180～220 g(广东省医学实验动物中心提供,SPF级)共30只,其中由于血糖过高死亡6只,将剩余24只大鼠随机分为正常对照组(C)、糖尿病组(D)和胰岛素干预组(Y)。链脲佐菌素(STZ)临用时溶于(pH=4.2) 0.1 mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液中,大鼠禁食10 h后,糖尿病大鼠以60 mg/kg单次腹腔注射STZ,正常对照组腹腔注射0.1 mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液1 ml/只。72 h后采大鼠尾静脉血测定血糖值,以随机血糖(BG)高于16.65 mmol/L作为糖尿病大鼠成模标准[1]。每日上午9:00～10:00,Y组大鼠给予鱼精蛋白锌胰岛素9～12 U/kg腹腔注射,C组和D组大鼠给予等量的0.9%氯化钠溶液腹腔注射。每周采大鼠尾静脉血测定血糖1次,共5周。观察期间,所有大鼠均自由饮水、摄食。环境温度为22℃,湿度为66%,昼夜循环光照及黑暗各12 h。5周后所有大鼠称重后行氯胺酮麻醉腹主动脉采血并处死,统一取右肾秤重,左肾一部分予10%中性甲醛固定用于免疫组化及光镜分析,处死前48 h收集24 h尿标本。

1.2 肾脏病理分析

肾脏标本经4%甲醛-PBS缓冲固定液固定后,常规石蜡包埋,切片(厚度3 μm),HE染色切片高倍镜(×400)下随机选择50个肾小球与50个肾小管间质视野(无肾小球与血管),应用病理图像分析系统软件(北京航空航天大学)测定肾小球平均面积。

1.3 UⅡ的免疫组化检测

肾脏标本经4%甲醛-PBS缓冲固定液固定后,常规石蜡包埋,切片(厚度3 μm),用免疫组化的方法进行检测。免疫组织化学步骤:将肾组织石蜡切片常规脱蜡至水,3% H2O2消除内源性过氧化酶30 min,微波法抗原修复12 min,血清封闭30 min,滴加Ⅰ抗( UⅡ多克隆抗体,由武汉博士德公司提供,稀释度1:2 000),4℃过夜。1:4稀释的蛋清封闭30 min,依次滴加Ⅱ抗(生物素化羊抗兔IgG) 37℃孵育30 min,Ⅲ抗(辣根素标记的链霉卵白素)37℃孵育30 min, DAB显色,苏木素复染。阴性对照以羊血清代替Ⅰ抗,其余步骤相同。之后脱水、封片、显微镜观察、摄像。细胞质呈棕黄色为阳性信号。显微镜400倍下,每组随机取10个肾小管间质视野,按阳性组织所占百分比进行半定量评分后取均值。

1.4统计学方法

计量资料以x±s表示。应用SPSS 12.0软件,各组间资料比较采用单因素方差分析,两两比较采用Student-Newman-Keuls检验。

2 结果

2.1 一般情况

与C组相比,D组大鼠体重显著降低(P

2.2 肾脏病理改变

图1为STZ诱导的糖尿病大鼠第5周时的肾脏肥大表现及胰岛素干预的影响。D组大鼠与C组相比,肾小球肥大,肾小管扩张、上皮细胞肿胀;而Y组肾小球肥大不明显。见图1。小球表面积检测表明,糖尿病大鼠肾小球较正常大鼠显著增大,Y组肾小球大小与正常组没有明显差别。见图2。

[C组:正常大鼠第5周的肾脏HE染色光镜显微照片(×400);D组:糖尿病大鼠组病理图片(HE,×400);Y组:胰岛素干预组大鼠肾脏病理图片(HE,×400)]

(左方柱状图代表每组8只大鼠的每25个肾小球的横截面积均数的比较,与C组相比,*P0.05)

2.3 UⅡ蛋白水平的表达

C组大鼠中UII蛋白有表达。免疫组化显示UⅡ主要分布于近端肾小管上皮细胞和间质,而肾小球仅有微量表达。与C组相比,D组肾组织中UⅡ在近端肾小管及间质处表达显著性增高(P

3 讨论

尾加压素Ⅱ(urotensin Ⅱ,UⅡ)是一种具有广泛生物学效应的血管活性肽。它最初是从鱼的脊髓尾垂体中分离出来的生长抑素样环肽[2]。1999年Ames等[3]首先发现人体内一种孤立的G蛋白耦联受体GPR14是UⅡ的特异性受体,UⅡ同其受体结合后导致细胞内Ca2+升高,引起一系列生物学效应,其缩血管效应比内皮素-1(ET-1)还强十余倍,是目前所知体内最强的缩血管活性肽。近年来,由于UⅡ的多种生物学效应,其在肾脏病学中的生理和病理作用受到研究者的重视。

Langham等[4]发现UⅡ及其受体(UT)mRNA在糖尿病肾病(DN)者出现大量表达,UⅡmRNA表达增加了45倍而UT mRNA表达增加了近2 000倍。同时,应用免疫组织化学方法在糖尿病肾病者肾脏小管上皮细胞定位了UⅡ肽及其受体结合物,而在非糖尿病者的肾组织均检测不出UⅡ及UT的结合物,动物实验也证实糖尿病诱导UⅡ在肾脏表达上调并参与TGF-β介导的肾脏纤维化[5]。近来发现尾加压素Ⅱ对体外培养大鼠肾成纤维细胞具有很强的促增殖作用[6]。这些研究说明UⅡ及UT受体在糖尿病肾病者肾脏出现的大量表达上调可能直接参与糖尿病肾病者基质增加的病理过程。

近年大量研究显示UⅡ在DN的发生发展中起重要作用:UⅡ呈浓度依赖性促进大鼠肾动脉舒张,并引起肾血流量增加、肾小球滤过率增加,还导致大鼠肾脏滤过分数增加[7];UⅡ受体特异性拮抗剂Palosuran能抑制UⅡ对系膜细胞的增殖作用[8]。

本研究通过STZ诱导SD大鼠糖尿病模型,首次观察到第5周末大鼠肾组织UⅡ蛋白的表达显著增加;运用胰岛素严格控制血糖可以部分减少糖尿病大鼠肾脏UⅡ蛋白的表达量,其作用机制可能与它通过抑制高血糖改变肾脏血管活性物质的平衡间接下调UⅡ蛋白的表达,其具体作用机制有待于进一步探讨。

[参考文献]

[1]周宜强.糖尿病研治新论[M].北京:中国医药科技出版社,1997:100-104.

[2]Gonlon JM,Yano K,Waugh D,et al.Distribution and molecular forms of urotensin II and its role in cardiovascular regulation invertebrates[J].J Exp Zool,1996,275(2):226-238.

[3]Ames RS,Sarau HM,Chambers JK,et al.Human urotnesin Ⅱ is a potent vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GRP14[J].Nature,1999,401(6750):282-286.

[4]Langham RG,Kelly DJ,Gow RM,et al.Increased expression of urotensin Ⅱ and urotensinⅡ receptor in human diabetic nephropathy[J].Am J Kidney Dis,2004,44(5):826-831.

[5]Tian L,Li C,Qi J,et al.Diabetes-induced upregulation of urotensin II and its receptor plays an important role in TGF-beta1-mediated renal fibrosis and dysfunction[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2008,295(5):1234-1242.

[6],李才,李相军,等.尾加压素Ⅱ对体外培养大鼠肾成纤维细胞的促增殖作用[J].中国老年学杂志,2009,29(12):1457-1459.

[7]Zhang AY,Chen YF,Zhang DX,et al.Urotensin II is a nitric oxide-dependent vasodilator and natriuretic peptide in the rat kidney[J].Am J Physiol Renal Physiol,2003,285(4):792-798.

[8]Behm DJ,McAtee JJ,Dodson JW,et al.Palosuran inhibits binding to primate UT receptors in cell membranes but demonstrates differential activity in intact cells and vascular tissues[J]. Br J Pharmacol,2008,155(3):374-386.

(收稿日期:2010-03-01)